染色體核型分析和熒光原位雜交技術(shù)對(duì)慢性粒細(xì)胞性白血病的診治意義

吳莉芳，饒若，王述文，夏夢(mèng)娟，姚紅霞

（海南省人民醫(yī)院 血液病研究室，海南 海口 570311）

慢性粒細(xì)胞性白血?。╟hronic myeloid leukemia，CML）具有特異性的Ph染色體和/或具有BCR/ABL融合基因[1]。Ph染色體是第9號(hào)與第22號(hào)染色體相互易位形成，BCR/ABL融合基因是由第9號(hào)染色體上的原癌基因與第22號(hào)染色體上的BCR基因相互易位形成[2]。根據(jù)BCR斷裂點(diǎn)的不同，可形成3種類型的融合基因，分別是m-型、M-型及μ型， 相應(yīng)翻譯成P190、P210及P230融合蛋白[3]。該文探討染色體核型分析和熒光原位雜交（fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH）2種方法在CML診治中的價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

選取2011年7月-2014年12月海南省人民醫(yī)院門診及住院CML患者218例。其中，男性126例，女性92例；年齡7～82歲，中位年齡41歲。本研究統(tǒng)計(jì)的數(shù)據(jù)均按標(biāo)本接收順序收錄，未進(jìn)行人工篩選取舍。

1.2 方法

1.2.1 骨髓形態(tài)學(xué)分析將骨髓涂片瑞氏染色，光學(xué)顯微鏡下觀察200個(gè)細(xì)胞分類計(jì)數(shù)。外周血涂片堿性磷酸酶染色，光學(xué)顯微鏡下觀察100個(gè)細(xì)胞，積分統(tǒng)計(jì)，綜合進(jìn)行FAB分型。將CML患者按照血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)[1]劃分為慢性期（chronic myeloid leukemia-chronic phase，CML-CP），加速期（chronic myeloid leukemia-acceleration phase，CML-AP），急變期（chronic myeloid leukemia-blastic phase，CML-BP）。CML患者治療后的骨髓片參照療效標(biāo)準(zhǔn)分為血液學(xué)完全緩解（chronic myeloid leukemia-complete response，CML-CR）、部分緩解、未緩解。

1.2.2 染色體核型分析取患者骨髓細(xì)胞，采用直接法和24 h短期培養(yǎng)法制備染色體，R顯帶技術(shù)進(jìn)行染色體核型分析。核型異常按人類細(xì)胞遺傳學(xué)國(guó)際命名體制[ISCN（2005）]加以描述。診斷標(biāo)準(zhǔn)為≥3個(gè)細(xì)胞有一致的染色體丟失，≥2個(gè)細(xì)胞有同樣的染色體增加或結(jié)構(gòu)異常[4]。剩余細(xì)胞懸液保存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 FISH采用熒光素標(biāo)記的位點(diǎn)特異性ES探針GLPBCR/GLPABL（中國(guó)北京金菩嘉醫(yī)療器械有限公司）。按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。

1.2.4 圖像掃描用Olympus BX51（日本Olympus公司）熒光顯微鏡在UV/Rhodamine/FITC三色濾光片的激發(fā)下觀察熒光雜交信號(hào)，每例分析200個(gè)細(xì)胞，用染色體分析系統(tǒng)VideoTesT-FISH 2.0（俄羅斯VideoTesT公司）進(jìn)行圖像采集和保存。

1.2.5 圖像分析及結(jié)果判讀紅色信號(hào)為ABL探針，位于9號(hào)染色體。綠色信號(hào)為BCR探針，位于22號(hào)染色體。當(dāng)紅色信號(hào)與綠色信號(hào)重疊時(shí)顯示黃色，即為融合信號(hào)。正常細(xì)胞的信號(hào)為2個(gè)紅色信號(hào)和2個(gè)綠色信號(hào)，無(wú)融合信號(hào)。異常細(xì)胞信號(hào)為：①2個(gè)紅色信號(hào)、1個(gè)綠色信號(hào)、1個(gè)黃色信號(hào)，提示主要斷裂點(diǎn)M-型，產(chǎn)生P210融合蛋白；②1個(gè)紅色信號(hào)、1個(gè)綠色信號(hào)、1個(gè)黃色信號(hào)，提示der（9）存在序列缺失（ABL或ASS基因缺失）；③1個(gè)紅色信號(hào)、1個(gè)綠色信號(hào)、2個(gè)黃色信號(hào)，提示次要斷裂點(diǎn)m-型，產(chǎn)生P190融合蛋白。＞8%細(xì)胞出現(xiàn)融合信號(hào)（黃色）即判斷為陽(yáng)性結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)處理采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)數(shù)資料以率（%）表示，比較做χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 骨髓形態(tài)學(xué)FAB分型

本研究收集218例CML患者標(biāo)本，其中CMLCP初 診 94例（43%）；CML-AP 7例（3%）；CMLBP 16例（7%）。CML-CR復(fù)查 33例（15%）。68例（31%）復(fù)查患者的骨髓片不符合正常骨髓象，也不符合CML-AP和CML-BP骨髓象的特點(diǎn)，將其歸為CML-CP。

2.2 染色體核型分析檢出率

2.2.1 Ph染色體171例CML標(biāo)本做染色體核型分析，116例檢出ph染色體，檢出率為68%。其中，CML-CP初診、CML-AP、CML-BP、CML-CP復(fù)查、CML-CR患者的Ph染色體檢出率分別為80%、100%、85%、60%和28%。

2.2.2 其他異常核型171例CML患者標(biāo)本中，22例存在其他異常核型。附表列出了18例具有代表性的異常核型，包括除典型9，22易位以外的所有其他染色體結(jié)構(gòu)及數(shù)量改變，如變異易位、復(fù)雜易位、隱匿易位等。

2.2.3 未檢出171例CML患者標(biāo)本中，22例標(biāo)本因分裂相少，質(zhì)量差，未能找到可分析的分裂相。

2.3 FISH檢出率

218例CML患者標(biāo)本做FISH，無(wú)不可檢測(cè)標(biāo)本，174例檢出BCR/ABL基因，檢出率為80%。其中CML-CP初診、CML-AP、CML-BP、CML-CP復(fù)查、CML-CR患者檢出率分別為93%、100%、100%、75%和39%。1例CML-BP患者檢出der（9）部分序列缺失，且產(chǎn)生的融合蛋白類型為P190。

2.4 染色體核型分析與FISH的檢出率比較

FISH對(duì)BCR/ABL融合基因的檢出率與染色體核型分析對(duì)Ph染色體的檢出率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=7.249，P=0.007），F(xiàn)ISH高于染色體核型分析。見(jiàn)附圖。

附表 18例伴有其他核型異常的CML患者

附圖 染色體核型分析與FISH的檢出率比較

3 討論

3.1 染色體核型分析

本研究中，其他異常核型的檢出率占13%，高于謝新等[5]的報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)在CML的各個(gè)分期中均檢出其他異常核型，與吳蔚等[6]的報(bào)道一致。本研究發(fā)現(xiàn)，在CML-AP和CML-BP患者中，其他異常核型檢出率高于CML-CP初診患者，與謝新等[5]的報(bào)道是一致。其他異常核型包括已報(bào)道的2Ph，+8，+21及i（17q）[5，7]，也有3條染色體間的復(fù)雜易位，如t（9；22；11）（q34；q11；q14）、t（9；9；22）（q21；q34；q11），以及 t（2；9；22）（q14；q34；q11）。

3.2 FISH

本研究發(fā)現(xiàn)CML-CP初診患者與CML-AP患者的BCR/ABL融合基因檢出率與文獻(xiàn)的報(bào)道一致，CML-BP患者的BCR/ABL融合基因檢出率高于文獻(xiàn)報(bào)道，CML-CR患者的BCR/ABL融合基因檢出率低于文獻(xiàn)報(bào)道[8]。

CML的BCR/ABL融合基因由主要斷裂點(diǎn)斷裂產(chǎn)生，其蛋白表達(dá)產(chǎn)物是P210。RAVANDI等[9]統(tǒng)計(jì)＞1 000例CML患者，發(fā)現(xiàn)CML斷裂點(diǎn)位于主要斷裂點(diǎn)以外的發(fā)生率＜1%，位于次要斷裂點(diǎn)的發(fā)生率更小。本研究結(jié)果表明，3.00% CML患者BCR/ABL融合基因產(chǎn)生的蛋白類型為P210共表達(dá)P190，0.95%CML患者BCR/ABL融合基因產(chǎn)生的蛋白類型為P190。

SINCLAIR等[10]首先發(fā)現(xiàn)并報(bào)道der（9）部分序列缺失與患者的生存率和疾病進(jìn)展關(guān)系密切，是一項(xiàng)強(qiáng)有力的負(fù)性預(yù)后因素。本研究發(fā)現(xiàn)，18% CML患者存在der（9）部分序列缺失，與吳煒等[11]的報(bào)道一致。其中，20% CML-CP、67% CML-AP、33% CML-BP、12% CML-CP復(fù)查、10% CML-CR患者存在der（9）部分序列缺失。結(jié)果表明，CML-AP和CML-BP的患者更易發(fā)生der（9）部分序列缺失，與董潔等[12]的報(bào)道一致。

3.3 2種檢測(cè)方法比較

171例CML患者標(biāo)本同時(shí)應(yīng)用染色體核型分析與FISH檢測(cè)，其中8例標(biāo)本（4.6%）的染色體核型分析為正常核型，但BCR/ABL融合基因陽(yáng)性，提示有隱蔽的BCR/ABL基因重排，與孫川等[7]的發(fā)現(xiàn)一致。FISH有助于可疑CML的診斷[13]，在CML的療效監(jiān)測(cè)中具有更好的優(yōu)勢(shì)[14]。

FISH可以通過(guò)對(duì)探針序列的巧妙設(shè)計(jì)，不同的信號(hào)方式提示更豐富的信息。既可以檢測(cè)BCR基因斷裂的位置，又可檢測(cè)der（9）的部分序列缺失。但是，往往復(fù)雜的信號(hào)方式解讀須參考染色體核型分析的結(jié)論。

171例染色體核型分析的CML患者標(biāo)本中，22例標(biāo)本因分裂相少，質(zhì)量差，未能找到可分析分裂相。而FISH不受細(xì)胞分裂期的影響，可以分析處于各個(gè)分裂期的細(xì)胞。

染色體核型分析可以發(fā)現(xiàn)其他異常核型，能夠全面了解染色體核型情況，但FISH只能檢測(cè)BCR/ABL融合基因及其相關(guān)序列。

綜上所述，染色體核型分析與FISH 2種遺傳學(xué)檢測(cè)方法分別提示不同的遺傳信息，兩者聯(lián)合應(yīng)用可為臨床對(duì)CML的診斷、用藥及預(yù)后提供可靠的依據(jù)。

參 考 文 獻(xiàn)：

[1]張之南, 沈悌.血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)[M].第3版.北京：科學(xué)出版社, 2007:134-138.

[2]MICHAEL W N, JOHN D, GODMAN M, et al.The molecular biology of chronic myeloid leukemia[J].Blood, 2000, 96(10):3342-3343.

[3]MELO J V.The diversity of BCR-ABL fusion proteins and their relationship to leukemia phenotype[J].Blood, 1996, 88(7):2375-2384.

[4]薛永權(quán).白血病細(xì)胞遺傳學(xué)及圖譜[M].天津：天津科學(xué)技術(shù)出版社, 2003:46-61.

[5]謝新, 過(guò)宇, 薛永權(quán).600例慢性粒細(xì)胞性白血病的細(xì)胞遺傳學(xué)分析[J].中華醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)雜志, 1998, 15(2):85-88.

[6]吳蔚, 顧健, 馬莉, 等.細(xì)胞遺傳學(xué)檢測(cè)在慢性粒細(xì)胞性白血病中的應(yīng)用價(jià)值[J].中華全科醫(yī)學(xué), 2015, 13(8):1320-1322.

[7]孫川, 李倩, 林穎, 等.慢性粒細(xì)胞性白血病額外染色體異常在加速期和急變期的意義[J].醫(yī)學(xué)研究雜志, 2014, 43(1):108-110.

[8]張濟(jì), 李君君, 顏家運(yùn), 等.熒光原位雜交仔慢性粒細(xì)胞性白血病細(xì)胞BCR/ABL融合基因檢測(cè)中的應(yīng)用及其意義[J].實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志, 2012, 28(5):825-827.

[9]RAVANDI F, CORT ES J, ALBITAR M, et al.Chronic myelogenous leukaemia with p185BCR-A BL expression:characteristics and clini cal significance[J].Br J Haematol, 1999,107:581-586.

[10]SINCLAIR P B, NACHEVA E P, LEVERSHA M, et al.Large deletions at the t (9; 22) breakpoint are common and may identify a poor-prognosis subgroup of patients with chronic myeloid leukemia[J].Blood, 2000, 95:738-744.

[11]吳煒, 薛永權(quán), 吳亞芳, 等.Ph染色體陽(yáng)性慢性粒細(xì)胞白血病衍生9號(hào)染色體缺失的FISH研究[J].中華血液學(xué)雜志, 2006,27:183-186.

[12]董潔, 李薇, 白晶, 等.9號(hào)衍生染色體在慢性粒細(xì)胞白血病預(yù)后評(píng)估中的意義[J].吉林大學(xué)學(xué)報(bào), 2016, 42(2):301-304.

[13]BACCARANI M, DEININGER M W, ROSTI G, et a1.European leukemia net recommendations for the management of chronic myeloid leukemia, 2013[J].Blood, 2013, 122(6), 872-884.

[14]National Comprehensive Cancer Network.NCCN clinical practice guidelines in oncology, chronic myelogenous leukemia version 2:2014 [S/OL].[2015-03-24].http://www.nccn.org／NCCN GuidelinesTM & Clinical Resources.