煙堿對腹腔感染敗血癥小鼠的保護(hù)作用及其機(jī)制研究*

賈寶輝，劉寧，陳奕，黃敏，尚明升，杜玉明

（1.鄭州鐵路職業(yè)技術(shù)學(xué)院，河南 鄭州 451460；2.南昌大學(xué)第四附屬醫(yī)院 重癥醫(yī)學(xué)科，江西 南昌 330003；3.鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院 重癥醫(yī)學(xué)科，河南 鄭州 450052）

致病菌入侵機(jī)體時，體內(nèi)的迷走神經(jīng)釋放遞質(zhì)乙酰膽堿與免疫系統(tǒng)相互作用參與抗炎，即膽堿能抗炎通路[1]。煙堿是煙堿型乙酰膽堿受體α-7亞基（α7 nicotinic acetylcholine receptor，α7AchR）特異性激動劑，通過與α7AchR結(jié)合，比乙酰膽堿抗炎效應(yīng)更強(qiáng)[2]。本研究應(yīng)用煙堿激活膽堿能抗炎通路，觀察其對敗血癥小鼠生存率、敗血癥嚴(yán)重程度，以及肝、肺組織病理學(xué)、血漿促炎癥細(xì)胞因子水平的影響，探討煙堿對敗血癥的保護(hù)作用及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

健康昆明小鼠，雌性，體重20～25 g（南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供）。采用盲腸結(jié)扎并穿孔（cecal ligation and puncture，CLP）法復(fù)制敗血癥動物模型。65只小鼠隨機(jī)分為對照組（15只）、CLP組（20只）和煙堿400μg/kg組（30只），用于觀察生存率和記錄平均生存時間。另取18只小鼠分組同上，每組6只，用于觀察一般狀況，20 h處死動物記錄大體形態(tài)學(xué)，計算肺濕干重比、敗血癥嚴(yán)重程度評分，取肝、肺組織行病理學(xué)檢查。另取120只小鼠隨機(jī)分為對照組、CLP組，以及煙堿400、200和40μg/kg組，每組24只，用于測定血漿促炎癥細(xì)胞因子腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-alpha，TNF-α）和白細(xì)胞介素-1β（interleukine-1β，IL-1β）水平。模型復(fù)制成功后，立即腹腔注射不同濃度煙堿或等量生理鹽水，之后每隔8 h追加注入，連續(xù)3 d共9次。

1.2 小鼠敗血癥模型的復(fù)制

參考文獻(xiàn)[3]復(fù)制敗血癥小鼠模型。術(shù)前禁食12 h，腹腔注射7%水合氯醛（350 mg/kg）麻醉。于左下腹做長約1.5cm切口，游離腸系膜和盲腸，以4號絲線環(huán)行結(jié)扎盲腸根部，用12號針頭于距盲端1cm處貫通穿刺，擠出糞便少許，還納腸系膜和腸管。逐層縫合關(guān)腹，碘伏消毒傷口。術(shù)畢皮下注射生理鹽水3 ml/100 g，并肌內(nèi)注射青霉素2萬u預(yù)防切口感染。對照組除開腹、游離并還納腸系膜及盲腸、縫合關(guān)腹外，不行CLP，其余處理同CLP組。

1.3 觀察指標(biāo)及檢測方法

1.3.1 生存率記錄對照組、CLP組和煙堿400μg/kg組小鼠24、36和48 h存活例數(shù)及生存率。共觀察7 d。

1.3.2 肺濕干重比CLP后20 h處死動物，分離雙側(cè)肺組織，取右側(cè)肺組織于紗布上吸凈血液，稱濕重后于65℃烤箱中24 h至恒重，稱干重，計算肺濕干重比。

1.3.3 敗血癥嚴(yán)重程度評分小鼠CLP后敗血癥嚴(yán)重程度評分采用改良的評定標(biāo)準(zhǔn)[4]進(jìn)行。從一般情況、腸管情況、腹水情況、結(jié)扎盲腸情況、病灶包裹情況、肝臟體積及肺濕干重比7個方面進(jìn)行評定。見表1。

1.3.4 病理學(xué)檢查CLP后20 h取肝、肺組織經(jīng)4%甲醛溶液固定，石蠟包埋切片，HE染色后普通光學(xué)顯微鏡下觀察。

表1 小鼠CLP后敗血癥嚴(yán)重程度評分標(biāo)準(zhǔn)

1.3.5 酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）采用 ELISA 測定血漿 TNF-α、IL-1β的濃度。于CLP術(shù)后1、2、4和6 h處死動物，摘眼球取血，經(jīng)離心后獲得血漿。TNF-α和IL-1β ELISA試劑盒購自武漢博士德生物公司。操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。使用CurveExpert 1.3軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計算出待測樣品濃度值，以pg/ml表示。每個待測樣品及標(biāo)準(zhǔn)品均作復(fù)孔。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用單因素方差分析或重復(fù)測量設(shè)計的方差分析，方差分析的兩兩比較用SNK-q檢驗，用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，生存率比較用Log-rank χ2檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 生存率比較

實驗觀察7 d對照組15只小鼠無一例死亡；CLP組20只小鼠術(shù)后24、36和48 h分別存活8、5和4只，生存率分別為40.0%、25.0%和20.0%；煙堿400μg/kg組30只小鼠術(shù)后24、36和48 h分別存活24、19和17只，生存率分別為80.0%、63.3%和56.7%。煙堿400μg/kg組與CLP組的生存率比較，經(jīng)Log-rank χ2檢驗，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=8.599，P=0.003），煙堿400μg/kg組生存率高于CLP組（P＜0.05）。見圖1。

圖1 3組小鼠生存率曲線

2.2 肺濕干重比

對照組、CLP組、煙堿400μg/kg組小鼠肺濕干重比分別為（2.71±1.58）、（5.10±0.39）和（2.30±1.03），經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=25.867，P=0.000）。進(jìn)一步兩兩比較經(jīng)SNK-q檢驗，CLP組20 h肺濕干重比高于對照組（P＜0.05）；煙堿400μg/kg組20 h肺濕干重比低于CLP組（P＜0.05）。

2.3 敗血癥嚴(yán)重程度評分

對照組、CLP組、煙堿400μg/kg組小鼠敗血癥嚴(yán)重程度評分分別為（6.47±0.74）、（21.00±2.37）和（15.00±3.58）分，經(jīng)單因素方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=28.760，P=0.000）。進(jìn)一步兩兩比較經(jīng)SNK-q檢驗，煙堿400μg/kg組20 h敗血癥嚴(yán)重程度評分低于 CLP 組（P＜0.05）。

2.4 病理學(xué)變化

2.4.1 肝組織對照組肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，肝小葉形態(tài)正常，肝血竇無擴(kuò)張和炎癥細(xì)胞浸潤。CLP組肝細(xì)胞濁腫、脂肪變性，可見灶性壞死，中性粒細(xì)胞浸潤明顯（見圖2A）。煙堿400μg/kg組肝細(xì)胞未見明顯濁腫，有輕度脂肪變性，未見有壞死灶。中性粒細(xì)胞浸潤程度較輕（見圖2B）。

2.4.2 肺組織對照組肺泡上皮細(xì)胞形態(tài)正常，肺間隔未見增寬，毛細(xì)血管無充血和淤血，肺間質(zhì)未見出血、水腫及炎癥細(xì)胞浸潤，肺泡大小均勻，結(jié)構(gòu)完整。CLP組肺泡結(jié)構(gòu)改變，間隔疏松增寬，肺泡內(nèi)毛細(xì)血管明顯充血，可見微血栓形成，肺間質(zhì)水腫，炎癥細(xì)胞浸潤明顯（見圖3A）。煙堿400μg/kg組肺泡結(jié)構(gòu)改變不明顯，未見毛細(xì)血管充血，肺間質(zhì)輕度水腫，炎癥細(xì)胞浸潤較輕（見圖3B）。

圖2 兩組肝組織病理結(jié)果 （HE×200）

圖3 兩組肺組織病理結(jié)果 （HE×200）

2.5 血漿TNF-α濃度

術(shù)后1、2、4和6 h對照組、CLP組，以及煙堿400、200和40μg/kg組血漿TNF-α濃度比較，采用重復(fù)測量設(shè)計的方差分析，結(jié)果：①不同時間點的血漿TNF-α濃度有差別（F=41.439，P=0.000）。②5組血漿TNF-α濃度有差別（F=79.356，P=0.000）。術(shù)后2、4和6 h時，CLP組較對照組血漿TNF-α濃度升高（P＜0.05），煙堿400、200和 40μg/kg組較CLP組血漿TNF-α濃度降低（P＜0.05）；6 h時煙堿400μg/kg組較200μg/kg組TNF-α濃度降低（P＜0.05）；2和6 h時，煙堿400μg/kg組較40μg/kg組血漿TNF-α濃度降低（P＜0.05）；2和4 h時，煙堿200μg/kg較40μg/kg組血漿TNF-α濃度降低（P＜0.05）。③5組間血漿TNF-α濃度變化趨勢有差異（F=44.172，P=0.000）。見表2和圖4。

表2 各組小鼠不同時間點血漿TNF-α濃度比較 （n =24，pg/ml，±s）

表2 各組小鼠不同時間點血漿TNF-α濃度比較 （n =24，pg/ml，±s）

組別 1 h 2 h 4 h 6 h對照組 242.06±9.64 260.02±19.75 245.74±12.60 256.53±14.82 CLP 組 248.89±10.76 435.26±20.91 869.76±24.61 731.11±42.56煙堿 400μg/kg 組 252.66±11.61 351.24±25.63 680.94±29.09 531.79±8.14煙堿 200μg/kg組 237.90±10.49 360.77±31.96 646.80±18.78 561.63±20.53煙堿 40μg/kg組 236.75±14.44 389.13±11.21 709.53±50.33 589.54±24.27

2.6 血漿IL-1β濃度

術(shù)后1、2、4和6 h對照組、CLP組，以及煙堿400、200和40μg/kg組血漿IL-1β濃度比較，采用重復(fù)測量設(shè)計的方差分析，結(jié)果：①不同時間點的血漿IL-1β濃度有差別（F=53.692，P=0.000）。②5組血漿IL-1β濃度有差別（F=78.062，P=0.000）。術(shù)后1、2、4和6 h時，CLP組較對照組血漿TNF-α濃度升高（P＜0.05）；術(shù)后1、2、4和6 h時，煙堿400μg/kg組較CLP組血漿TNF-α濃度降低（P＜0.05）；術(shù)后 1、4和 6 h時，煙堿 200μg/kg組較 CLP組血漿 TNF-α 濃度降低（P＜0.05）；術(shù)后1和6 h時，煙堿40μg/kg組較CLP組血漿 TNF-α 濃 度 降 低（P＜0.05）；4 h時 煙 堿400μg/kg組較200μg/kg組血漿TNF-α濃度降低（P＜0.05）；2和 6 h時，煙堿 400μg/kg組較40μg/kg組血漿 TNF-α 濃度降低（P＜0.05）；4 h時，煙堿200μg/kg較40μg/kg組血漿TNF-α濃度降低（P＜0.05）。③5組間血漿TNF-α濃度變化趨勢有差異（F=11.758，P=0.000）。見表3和圖5。

圖4 各組小鼠不同時間點血漿TNF-α濃度變化趨勢

表3 各組小鼠不同時間點血漿IL-1β濃度比較 （n =24，pg/ml，±s）

表3 各組小鼠不同時間點血漿IL-1β濃度比較 （n =24，pg/ml，±s）

組別 1 h 2 h 4 h 6 h對照組 267.34±27.10 261.23±29.13 221.95±30.45 245.19±35.03 CLP 組 327.63±21.27 337.63±19.50 456.17±7.08 556.12±7.08煙堿 400μg/kg 組 272.60±13.94 305.99±14.44 384.75±20.81 245.19±35.03煙堿 200μg/kg組 278.75±12.86 311.68±4.22 421.27±15.64 263.93±17.11煙堿 40μg/kg組 290.06±5.23 314.66±6.27 432.92±16.67 254.92±16.36

圖5 各組小鼠不同時間點血漿IL-1β濃度變化趨勢

3 討論

神經(jīng)-免疫調(diào)節(jié)通路在針對機(jī)體感染、創(chuàng)傷或缺血、缺氧等損害性刺激，而產(chǎn)生保護(hù)性防御反應(yīng)方面，起非常重要的作用。中樞神經(jīng)系統(tǒng)通過激活傳出迷走神經(jīng)纖維，釋放神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿，與各種免疫細(xì)胞上的α7AchR結(jié)合，抑制炎癥細(xì)胞因子的合成，增加抗炎癥細(xì)胞因子的合成，調(diào)節(jié)外周炎癥反應(yīng)，從而維持免疫穩(wěn)定。

體外培養(yǎng)的人巨噬細(xì)胞中加入乙酰膽堿，能夠明顯抑制TNF-α的合成，并且電刺激小鼠迷走神經(jīng)能減輕內(nèi)毒素血癥時全身性炎癥反應(yīng)。已知外周血單核細(xì)胞上存在的M和N 2種乙酰膽堿受體中，N受體與乙酰膽堿結(jié)合后，可抑制TNF-α的合成，即膽堿能抗炎通路主要是通過N受體的激活來實現(xiàn)[6]。共聚焦顯微鏡技術(shù)和逆轉(zhuǎn)錄PCR發(fā)現(xiàn)，膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)與天然免疫系統(tǒng)密切聯(lián)系的分子基礎(chǔ)在于巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞上的N型α-銀環(huán)蛇毒素敏感的乙酰膽堿受體（α7亞基）。把人巨噬細(xì)胞暴露于煙堿或乙酰膽堿后，可抑制TNF-α、IL-1和IL-18的釋放。迷走神經(jīng)的感覺神經(jīng)元上存在IL-1受體，IL-1與其結(jié)合后，刺激傳出迷走神經(jīng)釋放乙酰膽堿，乙酰膽堿與巨噬細(xì)胞上的α7亞基結(jié)合，從而抑制炎癥細(xì)胞因子產(chǎn)生[7]。

學(xué)者通過對膽堿能抗炎通路結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)的研究，陸續(xù)發(fā)現(xiàn)激活該通路的各種手段或物質(zhì)。在經(jīng)左冠狀動脈前降支結(jié)扎-開放法復(fù)制的大鼠心肌缺血再灌注損傷模型上，筆者觀察到應(yīng)用煙堿可減輕心肌細(xì)胞損傷，減少缺血面積，保護(hù)心肌組織。其機(jī)制在于煙堿激活膽堿能抗炎通路，降低體內(nèi)炎癥細(xì)胞因子水平[8]。

煙堿激活膽堿能抗炎通路對感染性休克保護(hù)作用的研究較少。已證實刺激內(nèi)毒素休克大鼠傳出迷走神經(jīng)，可以減緩低血壓性休克的發(fā)生時相，阻止血壓進(jìn)行性下降，增加體內(nèi)抗炎癥細(xì)胞因子的釋放，降低主要臟器組織和血漿中TNF-α含量。若迷走神經(jīng)切斷則明顯加重TNF-α對炎癥刺激的反應(yīng)，使動物對內(nèi)毒素的致死效應(yīng)更加敏感。CLP法更接近于臨床上急性腸穿孔或彌漫性腹膜炎所導(dǎo)致的敗血癥/感染性休克的病理生理過程。本實驗前期采用CLP法復(fù)制敗血癥動物模型，觀察到腹腔感染敗血癥小鼠肝、肺組織病理損傷嚴(yán)重[9]。本研究探討煙堿對CLP敗血癥動物生存率、一般狀況、敗血癥嚴(yán)重程度、重要臟器組織病理學(xué)的影響，證實煙堿能提高腹腔感染敗血癥小鼠的存活率，延長其生存時間，降低敗血癥嚴(yán)重程度的評分，減輕組織器官的病理損害。因此，煙堿對敗血癥動物具有保護(hù)作用。

本研究結(jié)果進(jìn)一步表明，敗血癥小鼠血漿中TNF-α和IL-1濃度升高，肝、肺組織炎癥病理改變明顯。而給予煙堿后，血漿中TNF-α和IL-1含量降低，肝、肺組織炎癥病理改變減輕，表明煙堿可減輕敗血癥時的全身性炎癥反應(yīng)，并具有保護(hù)肝、肺功能的作用。其機(jī)制可能是煙堿激活迷走神經(jīng)后，釋放大量乙酰膽堿，與存在于肝Kupffer細(xì)胞、單核細(xì)胞上的乙酰膽堿受體α7亞基結(jié)合，通過一系列途徑阻止Kupffer細(xì)胞和單核細(xì)胞釋放TNF-α和IL-1，從而拮抗肝臟組織乃至全身性的炎癥反應(yīng)，與ZABRODSKII等[10]的研究結(jié)果一致。

因此，煙堿對敗血癥動物保護(hù)作用的機(jī)制在于抑制炎癥細(xì)胞因子TNF-α和IL-1的釋放，即煙堿具有抗炎效應(yīng)。并且，這種保護(hù)作用及其拮抗炎癥介質(zhì)的效應(yīng)，可能與其劑量有一定的相關(guān)性。

膽堿能性抗炎通路的發(fā)現(xiàn)，使煙堿這一存在于煙草中，長期以來一直被人們認(rèn)為有毒的物質(zhì)得以重新評價。適量應(yīng)用煙堿可能有助于臨床上積極防治敗血癥/感染性休克。未來應(yīng)當(dāng)進(jìn)一步研究煙堿對調(diào)控炎癥介質(zhì)的上游信號分子，如核因子-кB、Toll樣受體等的影響，從分子水平上闡述受體與藥物分子相互作用的機(jī)制，開發(fā)出激活膽堿能抗炎通路，特別是針對α7AchR的新藥。

參 考 文 獻(xiàn)：

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