水稻早衰突變體psl4(t)的表型鑒定及基因定位

龔曉平，何煥然，莫春紅，李加勝，陳銳， 張致力，孫小紅，勾治琴，羅挺

重慶市渝東南農(nóng)業(yè)科學(xué)院，重慶 涪陵 408000

葉片是植物的重要器官,可通過光合作用為植株提供大量的能量和有機(jī)物,以保證其正常生長發(fā)育.葉片衰老作為葉片自然發(fā)育的必經(jīng)階段,由外部信號和內(nèi)部信號引起,是一個高度程序化的過程[1].該過程中細(xì)胞結(jié)構(gòu)、基因表達(dá)和細(xì)胞代謝有序變化,最初為葉綠體的破裂,接著葉綠素、蛋白質(zhì)、膜脂、RNA等有機(jī)大分子開始分解并向種子或者生長點(diǎn)轉(zhuǎn)移.該過程還受植物激素、一些代謝物的內(nèi)源性因素以及光合作用狀態(tài)等調(diào)控[2-4].葉片衰老作為植物發(fā)育過程中的重要環(huán)節(jié),研究葉片衰老在發(fā)育生物學(xué)中具有積極的意義[5]．

水稻是單子葉重要的模式植物,更是人類最重要的糧食作物之一,其增產(chǎn)對世界的糧食安全具有重要意義[6-7].秈型品種在中后期葉片易早衰,導(dǎo)致光合能力降低,限制了更多有機(jī)物的形成和積累,不利于結(jié)實率和千粒質(zhì)量等產(chǎn)量相關(guān)性狀的提高[8].葉片早衰是指水稻抽穗期至成熟期,葉片內(nèi)部生理功能失調(diào),生理活動受到限制,導(dǎo)致“未老先衰”的表型,出現(xiàn)莖葉枯萎、失綠及根系活性減弱等癥狀,致使源器官有機(jī)物合成不充足,籽粒不充實,空秕率迅速上升,千粒質(zhì)量下降,對水稻產(chǎn)量及米質(zhì)造成極大的損失和影響[9].在糧食生產(chǎn)中,水稻葉片早衰現(xiàn)象廣泛存在.有些水稻品種由于葉片和根系早衰而造成結(jié)實率偏低、空秕率較高,影響其產(chǎn)量潛力的發(fā)揮.理論上推算,水稻葉片如果推遲1d衰老,可使水稻增產(chǎn)2%左右,而實驗結(jié)果表明可增產(chǎn)約1%[10].有目的地對葉片早衰進(jìn)行調(diào)控,可以提高農(nóng)作物的產(chǎn)量或延長農(nóng)產(chǎn)品的貯藏期,因此,開展水稻葉片早衰相關(guān)突變體的表型鑒定,以及葉片衰老的生理生化指標(biāo)檢測和基因克隆研究對其在水稻的遺傳改良和衰老機(jī)制解析等方面具有重要意義．

葉片衰老過程中表達(dá)水平發(fā)生變化的基因稱為葉片衰老相關(guān)基因(senescence-associated genes,SAGs).目前,關(guān)于葉片早衰的機(jī)理研究較為深入,大多集中在分子和遺傳水平上,已有ESL9,OsDOS,OsPLS1,SPL28等20多個調(diào)控水稻SAGs完成了基因定位和部分功能解析[11].根據(jù)早衰突變體表型可分為兩種類型: 第一個類型是葉片黃化,早衰突變體esl9分蘗期葉尖開始黃化,逐漸延伸至葉片中段,一直持續(xù)到成熟期,其調(diào)控基因位于第11染色體,引起葉片淀粉積累,使光合系統(tǒng)受阻[12].OsDOSRNAi植株在孕穗期時葉片開始發(fā)黃,灌漿期時葉片明顯發(fā)黃,OsDOS可能通過或部分通過將發(fā)育信號與茉莉酸甲酯信號傳導(dǎo)通路進(jìn)行整合來延緩葉片的衰老[13].OsAkaGal的過表達(dá)植株表現(xiàn)為生長發(fā)育延遲且葉片變得灰綠,OsAkaGal是一個類囊體膜降解酶,在水稻葉衰老過程中通過參與雙半乳糖甘油二脂的降解從而調(diào)控水稻葉片衰老[14-15].第二個類型是葉片斑點(diǎn),早衰突變體ospls1分蘗期下部葉片出現(xiàn)類病斑癥狀,由葉尖和葉緣擴(kuò)展至葉片內(nèi)側(cè),其調(diào)控基因OsPLS1通過參與SA代謝途徑引起葉片衰老[9].SPL28編碼1個網(wǎng)格相關(guān)受體蛋白復(fù)合體亞基(AP1M1),參與調(diào)控高爾基體的物質(zhì)運(yùn)輸途徑和囊泡運(yùn)輸,功能缺陷造成水稻過敏性反應(yīng),葉片表現(xiàn)出類病斑,導(dǎo)致植株早衰[16].突變體rls1早衰的葉片在整個表面形成一些散布的、類似感病的黃棕色小斑點(diǎn),RLS1編碼1個具有NB-ARM結(jié)構(gòu)域的蛋白,參與葉綠體的降解,引發(fā)葉片快速衰老[17].葉片衰老是一個復(fù)雜的過程,盡管部分水稻葉片衰老基因被定位和克隆,但在蛋白合成降解、細(xì)胞程序性死亡、激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等階段還缺乏系統(tǒng)的認(rèn)知,需挖掘更多葉片早衰的調(diào)控基因,不斷豐富葉片早衰的調(diào)控網(wǎng)絡(luò),為水稻抗早衰品種選育提供堅實的理論基礎(chǔ)．

本研究從涪恢9802和LR雜交后代中鑒定了早衰突變體psl4(t),并對該葉片早衰基因進(jìn)行表型分析和基因定位.該突變體在6葉期前葉片呈正常綠色,從7葉至劍葉每張葉片從葉尖至葉中部逐漸衰老,其早衰調(diào)控候選基因定位于第4染色體上,與已報道的早衰基因位點(diǎn)均為非等位,是一個新的早衰基因.本研究對該水稻早衰基因的克隆、功能分析及分子調(diào)控機(jī)理的研究奠定了基礎(chǔ)．

1 材料與方法

1.1 試驗材料

水稻早衰突變體psl4(t)是從重慶市渝東南農(nóng)業(yè)科學(xué)院以涪恢9802和LR雜交后代中獲得的,經(jīng)連續(xù)多代自交選擇,早衰特性能夠穩(wěn)定遺傳.之后配制psl4(t)/0739NB,psl4(t)/431B和psl4(t)/中九B等3個雜交組合,利用F1及其自交F2群體進(jìn)行遺傳分析和基因定位.突變體psl4(t)和野生型(WT)種植于重慶市渝東南農(nóng)業(yè)科學(xué)院(重慶涪陵)試驗基地,常規(guī)肥水管理．

1.2 農(nóng)藝性狀及光合色素質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測定

水稻成熟后,分別取psl4(t)及WT各20株,對其株高、穗長、有效穗數(shù)、每穗粒數(shù)、結(jié)實率和千粒質(zhì)量等主要農(nóng)藝性狀進(jìn)行考種分析.每株隨機(jī)抽取20籽粒,利用游標(biāo)卡尺測定籽粒的長、寬、厚及長寬比．

參考Wellburn[18]的方法,抽穗期測定WT和psl4(t)倒1葉至倒3葉的光合色素質(zhì)量分?jǐn)?shù).準(zhǔn)確稱樣品葉片各0.05 g,并剪成均勻塊狀,將其放入裝滿95%乙醇溶液的4 mL離心管中,在4℃條件下避光處理24 h,輕輕搖晃多次,使色素完全溶解.吸取200 μL上清液,采用酶標(biāo)儀分別測量665,649和470 nm波長處的吸光值.光合色素質(zhì)量分?jǐn)?shù)計算公式參照文獻(xiàn)[19]．

1.3 透射電子顯微鏡觀察

參照He[20]的方法用電子顯微鏡觀察psl4(t)抽穗期劍葉葉尖黃色部分和WT葉尖部的細(xì)胞結(jié)構(gòu).戊二醛雙重固定后,利用不同梯度的乙醇逐級脫水,然后進(jìn)行置換和包埋,超薄切片后,以醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛液雙重染色,荷蘭飛利浦TECNAI10電子顯微鏡觀察并照相．

1.4 遺傳分析及基因定位

大田栽培條件下,調(diào)查psl4(t)/0739NB,psl4(t)/431B和psl4(t)/中九B的F1雜種葉色,確定控制突變體葉尖早衰癥狀的顯隱性; 根據(jù)其F2群體中具有正常葉色的水稻單株數(shù)與具有突變體性狀的單株數(shù)的比例,確定控制葉尖早衰性狀的基因數(shù)量; 隨后分單株選取親本材料psl4(t),中九B,同時在psl4(t)/中九B的F2群體中選取15株具有突變體性狀的單株以及15株具有野生型表型的植株葉片,采用CTAB法提取親本和基因池DNA,堿煮法提取F2代單株總DNA; 構(gòu)建正?；虺睾屯蛔兓虺?進(jìn)行連鎖標(biāo)記篩選,引物與PCR反應(yīng)體系參考王曉雯等[21]的方法.SSR(http: //www.gramene.org/)分子標(biāo)記引物由上海生工生物公司合成(表1),利用BSA法進(jìn)行基因連鎖分析[22]及基因定位,用Mapmaker 3.0軟件分析數(shù)據(jù)并作圖,根據(jù)Gramene網(wǎng)站(http: //www.gramene.org/)的水稻基因組信息構(gòu)建物理圖譜．

表1 psl4(t)基因連鎖標(biāo)記

2 結(jié)果與分析

2.1 突變體psl4(t)的表型及主要農(nóng)藝性狀

突變體psl4(t) 1～6葉期的葉片呈正常綠色,從7葉至劍葉每張葉片從葉尖至葉中部逐漸衰老.葉片葉綠體發(fā)育受阻其體積變小、光合色素質(zhì)量分?jǐn)?shù)減少,葉片提前衰老.抽穗期時,突變體psl4(t)的抽穗期極顯著長于野生型(圖1a),突變體psl4(t)的倒4葉出現(xiàn)葉尖早衰黃化(圖1b); 成熟期時,突變體psl4(t)主莖長度顯著短于野生型(圖1c),所有葉片全部表現(xiàn)嚴(yán)重黃化衰老癥狀(圖1d).透射電鏡分析表明,分蘗后期至抽穗期突變體psl4(t)劍葉部分葉綠體中的類囊體已開始降解,而且其葉綠體中的淀粉顆粒數(shù)量明顯少于對照,但淀粉顆粒大小明顯增大(圖2).此外,我們對野生型和突變體psl4(t)的主要農(nóng)藝性狀進(jìn)行了統(tǒng)計,結(jié)果顯示突變體psl4(t)的株高、每穗粒數(shù)和結(jié)實率極顯著低于野生型,分別下降8.49%,12.91%和7.73%(表2),表明突變體psl4(t)葉綠體結(jié)構(gòu)的破壞可導(dǎo)致葉片黃化早衰,影響植株的株高及產(chǎn)量．

圖1 突變體psl4(t)與野生型(WT)的表型

表2 野生型(WT)與突變體psl4(t)的主要農(nóng)藝性狀分析

cl為類囊體,sg為淀粉顆粒．圖2 突變體psl4(t)與野生型(WT)的劍葉葉尖葉肉細(xì)胞

2.2 光合色素質(zhì)量分?jǐn)?shù)測定

對抽穗期野生型和突變體psl4(t)倒1葉至倒3葉的光合色素質(zhì)量分?jǐn)?shù)進(jìn)行測定,結(jié)果表明突變體psl4(t)倒1葉(劍葉)、倒2葉和倒3葉的葉綠素a、葉綠素b、總?cè)~綠素及類胡蘿卜素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)(圖3)均極顯著低于野生型(WT).與野生型相比,突變體psl4(t)的倒1葉、倒2葉和倒3葉的總?cè)~綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別下降15.37%,14.80%和4.49%.因此,突變體psl4(t)葉片黃化早衰很可能是光合色素質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著降低所致．

1～3分別代表倒1葉至倒3葉; **表示p<0.01,差異有統(tǒng)計學(xué)意義．圖3 抽穗期野生型(WT)與突變體psl4(t)的倒1葉、倒2葉、倒3葉光合色素質(zhì)量分?jǐn)?shù)對比

2.3 突變體psl4(t)的遺傳分析

突變體psl4(t) 1～6葉期的葉片呈正常綠色,從7葉期至劍葉期每張葉片從葉尖至葉中部逐漸衰老.F1代表現(xiàn)為正常的葉色和壽命,說明該突變性狀表現(xiàn)為隱性遺傳.psl4(t)/0739NB,psl4(t)/431B和psl4(t)/中九B的3個F2代群體出現(xiàn)正常葉和衰老葉兩種情況,正常葉與早衰葉的單株數(shù)都符合經(jīng)典遺傳學(xué)分離比例3∶1(表3),表明突變體psl4(t)是由單隱性核基因控制．

表3 水稻早衰突變體psl4(t)與0739NB,431B和中九B雜交F2代的表型分離比

2.4 突變體psl4(t)的基因定位

基因定位中連鎖標(biāo)記的篩選采用近等基因池分析法.利用psl4(t)/0739NB的F2群體中具有突變性狀的102個單株作為基因初步定位群體,選擇該群體中15株野生型葉片等量混合構(gòu)建野生型基因池、15株早衰型葉片等量混合構(gòu)建早衰型基因池,用均勻分布于12條染色體的500對SSR標(biāo)記逐條分析其在psl4(t)和0739NB間的多態(tài)性,其中106對標(biāo)記在親本間表現(xiàn)多態(tài)性.用在親本間表現(xiàn)多態(tài)性的標(biāo)記對野生型基因池和早衰型基因池進(jìn)行多態(tài)性分析.結(jié)果位于第4染色體長臂的SSR標(biāo)記RM1155,RM142和RM3524在突變體基因池和正?；虺刂g存在明顯偏分離,說明psl4(t)位于第4染色體.利用102個早衰型單株驗證以上標(biāo)記,并根據(jù)重組單株數(shù)和重組單株分布情況,初步把psl4(t)定位在RM142和RM3524標(biāo)記之間,遺傳距離分別為8.0 cM和10.3 cM(圖4a)．

為了將psl4(t)限定在更小的范圍內(nèi),我們利用RM1155和RM3524標(biāo)記之間的16對標(biāo)記,對親本及基因池進(jìn)行PCR擴(kuò)增,找到其中的差異引物RM3708,RM16999,RM17004,RM17006,RM5742和RM6130(表1).利用分離群體的1 656個隱性單株將psl4(t)精細(xì)定位在BAC克隆OSJNBa0084A10的標(biāo)記RM17004和RM17006之間38.5 kb的范圍內(nèi)(圖4b和4c).根據(jù)日本晴基因組序列預(yù)測在這38.5 kb范圍內(nèi)有7個候選基因(圖4d和表4),分別是LOC_Os04g35260,LOC_Os04g35270,LOC_Os04g35280,LOC_Os04g35290,LOC_Os04g35300,LOC_Os04g35305,LOC_Os04g35310．

圖4 水稻葉尖早衰基因psl4(t)在第4染色體上的分子定位

表4 定位區(qū)間內(nèi)的候選基因及功能注釋

3 討論與結(jié)論

水稻葉片是光合作用、呼吸作用、蒸騰作用等重要的場所,同時也是影響水稻產(chǎn)量的源器官,因此克隆相關(guān)水稻葉片早衰基因?qū)τ诮馕鋈~片早衰分子機(jī)制具有重要意義.本研究中的突變體psl4(t)屬于葉片黃化類型突變體,6葉期前葉片呈正常綠色,從7葉期起至劍葉,葉尖開始黃化沿葉中部逐漸延伸; 進(jìn)一步通過農(nóng)藝性狀統(tǒng)計發(fā)現(xiàn),其穗長、有效穗和籽粒寬變化無統(tǒng)計學(xué)意義,而株高、每穗粒數(shù)、結(jié)實率及千粒質(zhì)量則顯著降低.早衰突變體psl1自苗期的心葉抽出開始,前1葉就開始變黃衰老[23];psl3則是從第6葉開始表現(xiàn)衰老,葉片從上部到基部衰老程度逐漸減輕,葉下部和葉鞘基本保持綠色[24];pse(t)葉片從抽穗期開始表現(xiàn)衰老,先在老葉上出現(xiàn)褐色斑點(diǎn),接著整張葉片黃化衰老,灌漿期葉鞘與上層葉片也迅速黃化衰老[25].與早衰突變體psl1,psl3和pse(t)的早衰表現(xiàn)不同,psl4(t)突變體從7葉開始出現(xiàn)葉尖黃化,逐漸向葉中部延伸且不會超過葉中部,葉中部到基部及葉鞘仍然保持綠色,對植株產(chǎn)量影響相對較輕．

水稻衰老過程中涉及的相關(guān)基因數(shù)量較多,調(diào)控路徑復(fù)雜,具有較為龐大的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)[18].根據(jù)基因的作用途徑可分為以下幾類: 葉綠體的發(fā)育及葉綠素降解途徑,蛋白質(zhì)合成、降解及轉(zhuǎn)運(yùn)途徑,激素調(diào)控途徑,細(xì)胞程序化死亡途徑等.各途徑既獨(dú)立又協(xié)同,共同調(diào)控葉片衰老過程的有序進(jìn)行.水稻的NYC1和NOL與葉綠素的降解相關(guān),NYC1,NOL基因編碼葉短鏈脫氫酶/還原酶,均定位在類囊體膜上,在促進(jìn)葉片衰老過程的葉綠素b降解中發(fā)揮重要作用[26].弱勢早衰突變體wls5的葉綠體發(fā)育異常,由于積累了過量的活性氧,導(dǎo)致葉片中的葉綠素嚴(yán)重降解,內(nèi)源植物激素紊亂[27].psl4(t)突變體葉片中的葉綠素發(fā)生大量降解,但與nyc1,nol和wls5不同的是其葉綠體的類囊體結(jié)構(gòu)也發(fā)生降解,且其葉綠體中的淀粉積累量減少.目前報道的與葉片早衰相關(guān)的淀粉積累突變體較少,OsSRT1RNAi植株在兩葉期表現(xiàn)早衰,成熟種子中的淀粉粒變小而松散,且OsSRT1編碼水稻中的組蛋白去乙?；?參與調(diào)控淀粉在植株中的積累[28].葉片早衰淀粉積累異常突變體esl9在葉片中淀粉合成增加,但是淀粉分解速率不及合成速率,導(dǎo)致葉片中合成的淀粉仍不能完全降解,故引起葉綠體中淀粉顆粒積累壓迫甚至損傷類囊體[14].與esl9不同,psl4(t)葉片中淀粉積累數(shù)量明顯減少,但淀粉顆粒明顯增大,推測可能是淀粉顆粒的積累導(dǎo)致葉綠體中類囊體結(jié)構(gòu)的損傷降解.遺傳分析發(fā)現(xiàn),psl4(t)突變體的早衰性狀受單隱性核基因控制; 利用分子標(biāo)記將目標(biāo)基因定位于第4染色體長臂端兩個SSR標(biāo)記(RM17004和RM17006)之間38.5 kb的范圍內(nèi),該區(qū)間有7個注釋基因.本研究發(fā)現(xiàn)葉早衰基因的時空表達(dá)與其余衰老基因有一定的差異,說明引起植物葉衰老的遺傳基礎(chǔ)復(fù)雜.通過對該早衰突變體psl4(t)的遺傳分析和基因定位,可以作為葉早衰分子機(jī)理研究的互補(bǔ)驗證和補(bǔ)充,在水稻的遺傳改良和衰老機(jī)制解析等方面具有重要意義．