基于香豆素衍生物的反應(yīng)型硫化氫熒光探針的合成與應(yīng)用

侯鵬　董玉晶　劉磊　夏春輝　李爽

摘要：該文基于光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移（PET）機(jī)制，利用H2S誘導(dǎo)探針分子結(jié)構(gòu)中的2，4-二硝基苯醚水解，抑制PET過程，合成一種反應(yīng)型H2S熒光探針。利用NMR和MS對(duì)探針1的結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征。通過光譜學(xué)測(cè)試和生物學(xué)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)，相對(duì)于其他測(cè)試物質(zhì)（陰、陽離子及生物分子），它對(duì)H2S具有良好的選擇性和靈敏度，可以在生理?xiàng)l件下檢測(cè)H2S。當(dāng)H2S加入到探針溶液后，溶液呈現(xiàn)出綠色熒光，在490nm熒光強(qiáng)度恢復(fù)75倍，當(dāng)探針的濃度為10.0μmol/L時(shí)，其對(duì)H2S的檢測(cè)限為3.0×10^-8mol/L；同時(shí)，探針成功實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)H2S的熒光成像，為其在生物學(xué)及醫(yī)學(xué)中的實(shí)際應(yīng)用奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：硫化氫：香豆素；熒光檢測(cè)；探針

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1674-5124（2018）02-0056-06

0引言

硫化氫（H2S）作為生物體內(nèi)重要的活性硫物種，在許多生理過程中發(fā)揮著重要的作用，如血管生成、神經(jīng)調(diào)節(jié)、細(xì)胞凋亡等。研究表明，H2S已成為繼一氧化氮和一氧化碳后第3個(gè)重要的生物信號(hào)分子，一些疾病包括老年癡呆、唐氏綜合癥、糖尿病以及肝硬化都會(huì)造成H2S含量的改變，生物體內(nèi)內(nèi)源性硫化氫在正常生理人血清中含量為30-100μmol/L，人腦中的含量高達(dá)160μmol/L；因此，有效監(jiān)測(cè)H2S水平，可為疾病的早期診斷提供監(jiān)察手段，定性及定量檢測(cè)生物信號(hào)分子已經(jīng)成為一個(gè)活躍和富有成果的研究領(lǐng)域。

目前，已報(bào)導(dǎo)的檢測(cè)H2S方法包括電化學(xué)法、比色法、氣相色譜法等。其中，熒光檢測(cè)通過實(shí)現(xiàn)對(duì)生物客體中重要物種（離子、分子、DNA、蛋白質(zhì)和細(xì)胞器等）分布和變化的實(shí)時(shí)檢測(cè)，揭示生物學(xué)功能，已經(jīng)成為了醫(yī)學(xué)診斷和生物學(xué)研究中最有效的分析手段之一。熒光探針因廉價(jià)易得，具有細(xì)胞膜穿透性，合成技術(shù)可控，分子量小不容易干擾周圍蛋白等生理環(huán)境，所以應(yīng)用的領(lǐng)域最為廣泛。為了闡明H2S水平對(duì)健康和疾病狀態(tài)的影響，通過熒光方法在生物樣品中選擇性地跟蹤H2S具有重要的意義。

本文設(shè)計(jì)的H2S熒光探針1，以2，4-二硝基苯基為識(shí)別基團(tuán)，香豆素類染料為信號(hào)表達(dá)基團(tuán)。在熒光探針1中，由于熒光團(tuán)與2，4-二硝基苯基之間的光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移（PET）過程，導(dǎo)致探針1的熒光被淬滅，所以探針1本身無熒光或發(fā)射出很弱的熒光。當(dāng)加入待測(cè)物H2S后，由于硫化氫具有較強(qiáng)的親核性，能與探針1發(fā)生親核取代反應(yīng)從而使識(shí)別基團(tuán)2，4-二硝基苯基離去，體系內(nèi)PET過程失效；同時(shí)，生成具有強(qiáng)烈綠色熒光的香豆素類染料3。通過反應(yīng)前后熒光光譜的變化，可以建立一種檢測(cè)硫化氫的分析方法。具體響應(yīng)過程如圖1所示，該過程為一種熒光增強(qiáng)型硫化氫熒光探針。

1實(shí)驗(yàn)部分

1.1儀器與試劑

Bruker AV400光譜儀（400mHz）和Bruker ultraflex II基質(zhì)輔助時(shí)間飛行質(zhì)譜（美國Bruker）；LS45-熒光分光光度計(jì)（美國Perkin）；UV2450型紫外-可見分光光度計(jì)（日本島津）。

4-二乙胺基水楊醛，瑪雅試劑公司；2，4-二硝基氟苯，安耐吉試劑有限公司；碳酸鉀，天津市福晨化學(xué)試劑廠；二氯甲烷，天津市東麗區(qū)天大化學(xué)試劑廠；丙二腈，純度99%，安耐吉試劑有限公司；三乙胺，二甲基亞砜，十六烷基三甲基溴化銨，上海國藥試劑有限公司；碳酸鈉，氟化鈉，氯化鈉，溴化鈉，碘化鈉，磷酸二氫鈉，硝酸鈉，醋酸鈉，碳酸氫鈉，硫酸鈉，亞硫酸鈉，次氯酸鈉，氯化鈣，氯化銅，氯化鎂，氯化鋅，硫氫化鈉（HzS的來源），半胱氨酸，谷胱甘肽均購置于上海國藥試劑有限公司。

1.2熒光探針1的合成

將4-二乙胺基水楊醛193mg（1mmol），2，4-二硝基氟苯220mg（1.2mmol）和碳酸鉀170mg（1.2mmol），溶解在15mL乙腈溶液中。將反應(yīng)液升溫至85℃反應(yīng)8h，反應(yīng)結(jié)束后，降至室溫，倒入100mL水中，用50mL二氯甲烷萃取，飽和氯化鈉洗滌，有機(jī)層用無水硫酸鈉干燥。40℃旋去溶劑，得到淡黃色液體為化合物2。將化合物2溶于15mL二氯甲烷溶液中，向反應(yīng)液中加入丙二腈51mg（0.78mmol），三乙胺2滴，室溫?cái)嚢?h，反應(yīng)結(jié)束后，用35mL二氯甲烷萃取，無水硫酸鈉干燥，粗產(chǎn)物進(jìn)行柱層析分離（石油醚：乙酸乙酯=2：1，填料硅膠），得到淡黃色固體即為熒光探針1（收率：67%）。¹HnMR（400MHz，DMSO）δ8.92（d，J=2.6Hz，1H），8.47（dd，J=9.3，2.7Hz，1H），8.27（d，J=9.4Hz，1H），8.04（s，1H），7.24（d，J=9.3Hz，1h），6.96（d，J=9.5hz，1h），6.60（s，1h），3.52～3.42（m，4H），1.10（t，J=7.1hz，6H）。HRMS（EI）m/zcalcdfor[C20H17N5O5+H]+：408.1239，F(xiàn)ound：408.1241。

1.3光譜性質(zhì)測(cè)試

探針母液的配制：將適量探針溶解于少量的二甲基亞砜（DMSO）中，然后用含有3×10^-3mol/L十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）的PBS緩沖液配制成1.0×10^-3mol/L的溶液，4℃冷藏備用。

被分析物質(zhì)溶液的配制：將被分析物質(zhì)Na2CO3、NaF，NaCl，NaBr，NaI，NaH2PO4，NaNO3，NaOAc，NaHCO3、Na2SO4，Na2SO3、NaCIO、Cys、GSH、CaCl2，CuCl2，MgCl2、ZnCl2、NaHS分別經(jīng)二次水溶解，配制成1×10^-2mol/L的溶液，4℃冷藏備用。

測(cè)試溶液的配制及熒光測(cè)試參數(shù)的設(shè)定：將0.03mL探針母液移取至含有3×10^-3mol/LcTAB的PBS緩沖液的試管中，隨后加入被分析物，定容至3.0mL，混合均勻，靜置15min，進(jìn)行光譜測(cè)試。激發(fā)光和發(fā)射光的狹縫寬度均為5.0nm，電壓為700V。

1.4細(xì)胞培養(yǎng)及探針分子的熒光成像

將A549細(xì)胞（腺癌人類肺泡基底上皮細(xì)胞）置于10%胎牛血清和1%雙抗的細(xì)胞培養(yǎng)基中，37℃和5%CO2的條件下孵育，實(shí)驗(yàn)前，將狀態(tài)良好的細(xì)胞消化，接種至激光共聚焦的細(xì)胞培養(yǎng)皿內(nèi)，37℃和5%CO2的條件下繼續(xù)孵育12h，至細(xì)胞貼壁，進(jìn)行探針分子在細(xì)胞內(nèi)的熒光成像實(shí)驗(yàn)。第1組實(shí)驗(yàn)：細(xì)胞經(jīng)緩沖溶液PBS反復(fù)漂洗后，向盛放細(xì)胞的培養(yǎng)皿中加入5.0μmol/L探針溶液，帶細(xì)胞孵育30min后，用PBS緩沖液反復(fù)漂洗細(xì)胞，進(jìn)行熒光成像實(shí)驗(yàn)。第2組實(shí)驗(yàn)：細(xì)胞經(jīng)緩沖溶液PBS反復(fù)漂洗后，向盛放細(xì)胞的培養(yǎng)皿中加入30.0μmol/Lh2S溶液，帶細(xì)胞孵育30min后，用PBS緩沖液反復(fù)漂洗細(xì)胞，繼續(xù)向盛放細(xì)胞的培養(yǎng)皿中加入5.0μmol/L探針溶液，帶細(xì)胞孵育30min后，用PBS緩沖液反復(fù)漂洗細(xì)胞，進(jìn)行熒光成像實(shí)驗(yàn)。

2結(jié)果與分析

2.1熒光光譜研究

探針在pH7.4、含1.5mmol/LcTAB的50.0mmol/LPBS緩沖溶液中對(duì)H2S的響應(yīng)情況如圖2所示?；诠庹T導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移機(jī)制，探針分子結(jié)構(gòu)中的羥基被2，4-二硝基苯基保護(hù)，導(dǎo)致探針分子的熒光淬滅，因此單獨(dú)的探針分子溶解在緩沖溶液中未呈現(xiàn)出熒光發(fā)射峰；然而，當(dāng)加入H2S后，H2S將進(jìn)攻探針分子結(jié)構(gòu)中的酯鍵，釋放出具有強(qiáng)烈熒光的香豆素染料3，此時(shí)PET機(jī)制受阻，溶液呈現(xiàn)出綠色熒光，隨著滴加H2S濃度的增大（0，1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，20，30，40，50，60，70μmol/L），探針溶液在490nm處呈現(xiàn)的熒光發(fā)射峰強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)。當(dāng)加入H2S的濃度為70μmol/L，此時(shí)探針溶液在490nm處的熒光強(qiáng)度可以恢復(fù)（F/F0）75倍（F：探針分子與H2S作用后的熒光強(qiáng)度，F(xiàn)0：探針分子的熒光強(qiáng)度）。從探針溶液在490nm處熒光發(fā)射峰的熒光強(qiáng)度與H2S濃度關(guān)系（圖3）中可以看出，在0～7.0μmol/L之間，熒光強(qiáng)度與H2S濃度具有很好的線性關(guān)系，擬合后得到方程為y=9.2617+11.350x，線性相關(guān)系數(shù)為0.9987。根據(jù)IUPAC規(guī)定，信噪比S/N=3可以計(jì)算出探針分子1（10μmol/L）對(duì)H2S的檢測(cè)限為3.0×10^-8mol/L。由此表明文中制得的探針能夠在水溶液中定性和定量檢測(cè)H2S。對(duì)比探針溶液加入H2S前后的顏色變化，在紫外燈照射下，探針溶液顏色由無色變?yōu)榫G色。

2.2選擇性和干擾實(shí)驗(yàn)

為了證明文中制備的探針分子對(duì)復(fù)雜檢測(cè)環(huán)境中H2S的識(shí)別能力具有專一性，實(shí)驗(yàn)中對(duì)探針的選擇性及抵抗其他物質(zhì)干擾的能力進(jìn)行了詳細(xì)研究。實(shí)驗(yàn)中將生物環(huán)境中18種常見的陰、陽離子及生物分子和s^2-分別加入到探針的溶液中，充分反應(yīng)后，檢測(cè)光譜變化。如圖4所示，向探針1的溶液中分別加入等量的上述陰、陽離子及生物分子后，光譜行為顯示加入H2S的探針溶液的熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)，溶液發(fā)出強(qiáng)烈的綠色熒光：而其他測(cè)試物質(zhì)分別加入到探針溶液中，均沒有引起探針溶液熒光的顯著增強(qiáng)。同時(shí)，實(shí)驗(yàn)中分別將CO32-，F(xiàn)-，Cl-，Br-，I-，H2PO4-，NO3-，OAc-，HCO3-，SO42-，SO32-，CIO-，Cys，GSH，Ca2+，Cu2+，Mg2+，Zn2+作為共存物與H2S混合，觀察加入的共存物質(zhì)對(duì)探針與H2S二者反應(yīng)體系熒光行為的干擾情況。結(jié)果顯示，探針分子1對(duì)H2S的檢測(cè)幾乎沒有受到共存物質(zhì)的影響，表現(xiàn)出探針1具有較強(qiáng)的抵抗外界干擾并特異性識(shí)別H2S的能力。

2.3 pH的影響

反應(yīng)型熒光探針的光學(xué)性質(zhì)往往會(huì)受到檢測(cè)環(huán)境的pH值影響，因此文中詳細(xì)探究了不同pH條件下探針對(duì)H2S的檢測(cè)能力，優(yōu)化出探針能夠檢測(cè)H2S最佳的工作pH范圍。實(shí)驗(yàn)中考察了探針分子在不同pH值環(huán)境中的熒光行為，在pH 2-12范圍內(nèi)，探針分子本身的熒光強(qiáng)度無明顯變化，說明單獨(dú)的探針未受pH改變的影響，具有良好的穩(wěn)定性。同時(shí)考察了探針分子與H2S反應(yīng)體系溶液的熒光強(qiáng)度隨pH值不同的變化，如圖6所示，當(dāng)pH為2-5時(shí)，隨著pH的增大反應(yīng)溶液的熒光強(qiáng)度也迅速增強(qiáng)；當(dāng)6-10時(shí)，溶液有明顯的熒光增強(qiáng)，表明探針可以在較寬的pH區(qū)域?qū)2S進(jìn)行檢測(cè)；當(dāng)反應(yīng)體系的pH值繼續(xù)增大，反應(yīng)體系溶液的熒光強(qiáng)度逐漸降低。因此，實(shí)驗(yàn)中確定生理pH值7.4作為探針1與H2S反應(yīng)體系的pH值。

2.4穩(wěn)定性

實(shí)驗(yàn)中將探針溶解在含有1.5×10^-3mmol/LCTAB的50.0mmol/L PBS緩沖溶液中，靜置一段時(shí)間（40min），期間檢測(cè)熒光強(qiáng)度，制得的探針溶液在室溫下放置熒光強(qiáng)度無明顯變化，具有良好的光穩(wěn)定性。在探針溶液中加入70μmol/Lh2S后，檢測(cè)490nm處的熒光強(qiáng)度隨時(shí)間的變化，如圖7所示。二者混合后，迅速反應(yīng)，探針分子結(jié)構(gòu)中的酯鍵受到H2S的進(jìn)攻，釋放出香豆素染料3，表現(xiàn)為490nm處的熒光強(qiáng)度迅速增強(qiáng)，大約15min反應(yīng)達(dá)到平衡，同時(shí)，二者反應(yīng)的產(chǎn)物在室溫下也呈現(xiàn)出良好的光穩(wěn)定性，轉(zhuǎn)化成產(chǎn)物的熒光強(qiáng)度隨時(shí)間變化基本恒定不變。由此表明，光學(xué)性能穩(wěn)定的探針分子1適用于實(shí)際樣品的H2S檢測(cè)。

2.5細(xì)胞成像研究

實(shí)驗(yàn)中將A549細(xì)胞作為載體，考察探針分子在細(xì)胞中對(duì)H2S的檢測(cè)能力，將狀態(tài)良好的A549細(xì)胞首先置于H2S（30μmol/L）溶液，37℃培養(yǎng)30min，經(jīng)緩沖液PBS沖洗3次后，再加入探針溶液（5.0μmol/L），孵育30min，經(jīng)緩沖液PBS沖洗后，置于激光共聚焦顯微鏡下，可以觀察到細(xì)胞呈現(xiàn)出強(qiáng)烈的綠色熒光信號(hào)。對(duì)照實(shí)驗(yàn)，將細(xì)胞處于探針溶液（5.0μmol/L）中37℃培養(yǎng)30min，經(jīng)緩沖液PBS沖洗3次后，置于激光共聚焦顯微鏡下，細(xì)胞內(nèi)幾乎沒有熒光發(fā)出。由此表明，文中制得的探針分子能夠穿透細(xì)胞膜實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞內(nèi)H2S的光學(xué)響應(yīng)，具有很好的生物學(xué)應(yīng)用前景。

3結(jié)束語

本文以2，4-二硝基苯基為識(shí)別基團(tuán)，香豆素類染料為信號(hào)表達(dá)基團(tuán)，基于光誘導(dǎo)轉(zhuǎn)移（PET）機(jī)制，合成了反應(yīng)型H2S熒光探針。相對(duì)于其他測(cè)試物質(zhì)（陰、陽離子及生物分子），該探針對(duì)H2S具有良好的選擇性和靈敏度，可以在生理?xiàng)l件（pH 7.4）下檢測(cè)H2S。當(dāng)探針的濃度為10μmol/L時(shí)，其對(duì)H2S的檢測(cè)限為3.0×10^-8mol/L，在890nm熒光強(qiáng)度最大增強(qiáng)75倍，以上研究表明，探針在環(huán)境及生物學(xué)檢測(cè)方面具有潛在的應(yīng)用能力。