化裁消癭方抑制免疫缺陷小鼠甲狀腺癌成纖維細(xì)胞機(jī)制研究

周思聰

（福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二人民醫(yī)院甲狀腺血管疝外科，福建 福州 350001）

甲狀腺癌是臨床最常見(jiàn)的內(nèi)分泌惡性腫瘤之一，約占全部惡性腫瘤的1%。根據(jù)我國(guó)2022年衛(wèi)生組織公布數(shù)據(jù)：甲狀腺癌的發(fā)病率以每年約4%的速度上升，已成為全球發(fā)病率增長(zhǎng)最快的惡性腫瘤。對(duì)于甲狀腺乳頭狀癌，如薛立齋所云：“堅(jiān)硬不可移曰石癭”早期查體時(shí)發(fā)現(xiàn)甲狀腺結(jié)節(jié)質(zhì)硬，不能隨吞咽上下移動(dòng)，推之不動(dòng)，與周圍邊界不清。糾其病機(jī)，亦責(zé)之于氣、痰、瘀結(jié)聚。痰凝、血瘀、氣滯日久結(jié)于頸前，日久蘊(yùn)毒乃發(fā)石癭之病。故推測(cè)甲狀腺乳頭狀癌的發(fā)病與氣、血、水運(yùn)行失常相關(guān)，病灶位之肝、脾[1]。根據(jù)本病的主要臨床表現(xiàn)[2]，中醫(yī)將其類屬于癭瘤范疇?；钛`方是陳如泉教授臨床治療甲狀腺腫的經(jīng)驗(yàn)方[3]，已有臨床研究顯示[4-5]，活血消癭方治療結(jié)節(jié)性甲狀腺腫作用優(yōu)于優(yōu)甲樂(lè)，具有肯定的臨床療效及安全性。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 藥品及試劑

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 BALB/C裸鼠（SPF級(jí)）60只，雌性；體質(zhì)量（18±2）g。

1.1.2 試劑與儀器 主要試劑與試劑盒：RPMI 1640基本培養(yǎng)基（美國(guó)Gibco公司）、DMSO（德國(guó)Wcker Chemie公司）、碘125I甲狀腺球蛋白試放射免疫分析藥盒。主要儀器：震蕩器（公司：常州國(guó)華，型號(hào)：SHA-B）、CO2培養(yǎng)箱（公司：美國(guó)Revco，型號(hào)：300/3000）、高壓蒸汽滅菌鍋（公司：美國(guó)Zealway，型號(hào)：GI54DWS）、電冰箱（-24～8 ℃）公司：青島海爾，型號(hào)：BCD）、γ-放射免疫計(jì)數(shù)器（公司：西安二六二廠，型號(hào)：FJ-2021）、電熱恒溫水箱（公司：天津泰斯特，型號(hào)：600型）[6]。

1.1.3 動(dòng)物 在相對(duì)無(wú)菌的通風(fēng)清潔SPF級(jí)環(huán)境中，飼喂的6～8周齡的成年免疫缺陷鼠將成為最佳人腫瘤細(xì)胞接種鼠。根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)窟M(jìn)行皮下接種腫瘤細(xì)胞株進(jìn)行造模。分組與處理：將造模完成的免疫缺陷小鼠進(jìn)行篩選，剔除腫瘤過(guò)大或過(guò)小的甲狀腺癌小鼠，將篩選完的小鼠隨機(jī)平均分為4個(gè)組，分別為對(duì)照組、低劑量組、中劑量組、高劑量組，對(duì)低劑量組、中劑量組、高劑量組進(jìn)行灌胃化裁消癭方溶液，其中相對(duì)應(yīng)的喂養(yǎng)成人用量的5倍、10倍、20倍計(jì)算，分別對(duì)小鼠進(jìn)行灌胃治療，每次灌胃量為0.4 mL，對(duì)照組予等體積無(wú)菌蒸餾水0.4 mL，連續(xù)灌胃14 d[7]。

1.2 方法

1.2.1 藥品制備 主要分為3個(gè)小組：將化裁消癭方（方藥組成：夏枯草12 g、柴胡9 g、半夏9 g、莪術(shù)9 g、郁金6g、白術(shù)9 g、茯苓12 g、甘草6 g）依據(jù)用量不同分3組。其中主要以6 g/kg（低劑量組）、12 g/kg（中劑量組）、24 g/kg（高劑量組），分別對(duì)小鼠進(jìn)行灌胃治療[8]。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)

1.2.2.1 甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞的復(fù)蘇 ①?gòu)囊旱蘩飳⒓?xì)胞株取出，凍存管中的2/3放進(jìn)37 ℃水浴鍋中，通過(guò)最大速度振蕩，令其迅速在2 min內(nèi)融化[9]。②經(jīng)酒精消毒過(guò)雙手后，將酒精燈點(diǎn)燃，拿酒精棉球擦拭培養(yǎng)基的瓶口，分別用酒精燈對(duì)瓶口和瓶蓋消毒，將它們分別放在酒精燈兩側(cè)。③將15 mL離心管用封口膜封口，放置離心機(jī)中，并且將離心管配平。1 000 r離心5 min。④將裝有細(xì)胞株的離心管拿出，在培養(yǎng)瓶的瓶身處做上實(shí)驗(yàn)標(biāo)記，用手指輕輕晃動(dòng)使細(xì)胞分散均勻。

1.2.2.2 培養(yǎng)液的更換 ①首先將瓶子通過(guò)紫外線消毒大概30 min，之后放在超凈工作臺(tái)上，然后雙手進(jìn)行消毒。②把瓶身保持干凈，然后再采用酒精對(duì)瓶口進(jìn)行擦拭，同時(shí)瓶蓋也是需要進(jìn)行消毒，具體消毒時(shí)間一般再反復(fù)打開(kāi)瓶蓋5～6次以后再進(jìn)行消毒。③瓶口在酒精燈上消毒2～3次。④拿出 1個(gè)5 mL的巴氏滴管，吸管進(jìn)行懸空，吸取內(nèi)部培養(yǎng)液體。然后懸空移入到培養(yǎng)皿中。在此過(guò)程中在把實(shí)驗(yàn)試劑和相關(guān)超工作臺(tái)器材進(jìn)行取出[10]。⑤培養(yǎng)瓶放置再37 ℃，5%二氧化碳培養(yǎng)液中，然后不斷地進(jìn)行觀測(cè)，看自身在2～9 h后，纖維細(xì)胞生長(zhǎng)情況。

1.2.2.3 細(xì)胞株的保存 ①消毒大概30 min以后，需要開(kāi)啟全新超干凈工作臺(tái)[11]。②操作核心就是培養(yǎng)皿和操作臺(tái)的干凈，在此過(guò)程中需要將酒精的棉化不斷的進(jìn)行放在的培養(yǎng)的瓶口進(jìn)行慢慢的擦拭。③將培養(yǎng)皿中胰島素導(dǎo)入器皿中，在此過(guò)程中需要5 min，等細(xì)胞之間具有空洞以及各種縫隙在找合適機(jī)會(huì)進(jìn)行填充。④吸取在此過(guò)程中，主要的在此基礎(chǔ)上2 mL主要培養(yǎng)的各種的在此基礎(chǔ)上在此過(guò)程中在反復(fù)的沖洗的過(guò)程中需要各種的15～20次，在此基礎(chǔ)上需要不斷進(jìn)行封口以及在此基礎(chǔ)上需要的做的則是在離心機(jī)的平均的轉(zhuǎn)速位1 000 r離心5 min[12]。⑤需要在此將離心管中的一些廢棄倒入到缸中，在加入離心管需要加入2 mL完全培養(yǎng)，在用3 mL巴氏滴管輕柔吹吸30次左右使細(xì)胞分散均勻。

1.2.2.4 動(dòng)物模型的制備 60只5周齡左右，所有的小白鼠的都是在實(shí)驗(yàn)一周，這樣傳到0.25%胰酶消化離心，在放入到?jīng)]有血清的培養(yǎng)皿中其中對(duì)于該濃度為1×106個(gè)/0.1 mL，在此細(xì)胞的懸浮液，必須的操作者是無(wú)菌的進(jìn)行而且必須的戴口罩，手部也是進(jìn)行全方面的消消毒。每日用游標(biāo)卡尺測(cè)量記錄每只小裸鼠腫瘤的長(zhǎng)徑與寬徑，每次測(cè)量?jī)杀?。接種后12 d，接種人甲狀腺癌裸鼠移植瘤動(dòng)物隨機(jī)分為4組，分別予等體積的無(wú)菌蒸餾水、低劑量化裁消癭方溶液、中劑量化裁消癭方溶液、高劑量化裁消癭方溶液0.4 mL進(jìn)行灌胃治療，每日1次，連續(xù)灌 胃14 d。

1.2.3 取材和指標(biāo)檢測(cè) 對(duì)實(shí)驗(yàn)8周以后的老鼠，在進(jìn)行雙甲狀腺，主要在于保存，采用相關(guān)儀器給監(jiān)測(cè)，結(jié)果以A-lphaEase FC軟件取值，大鼠甲狀腺細(xì)胞凋亡水平；PCNA計(jì)算指標(biāo)的測(cè)定與標(biāo)本的采集分別于模型制備完成后d1、d2、d4、d8、d12、d14定期測(cè)量裸鼠抑瘤率。灌胃治療結(jié)束后第1天，即接種后27 d將各組裸鼠以頸椎脫臼法處死，取出瘤體組織。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）進(jìn)行描述。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠甲狀腺組織中PCNA的表達(dá) 對(duì)照組平均灰度值為（5 673±444），低劑量組平均灰度值為（6 236±567），中劑量組平均灰度值為（9 065± 721），高劑量組平均灰度值為（8 097±456）。由此可見(jiàn)，低、中、高劑量活血消癭方均可降低模型大鼠甲狀腺細(xì)胞PCNA的表達(dá)。見(jiàn)表1。

表1 PCNA在大鼠甲狀腺細(xì)胞中表達(dá)（±s）

表1 PCNA在大鼠甲狀腺細(xì)胞中表達(dá)（±s）

2.2 各組大鼠甲狀腺細(xì)胞凋亡水平 對(duì)照組平均灰度值為（40.76±2.24），低劑量組平均灰度值為（22.67±5.18），中劑量組平均灰度值為（22.46± 6.99），高劑量組平均灰度值為（17.15±4.59）。由此可見(jiàn)，低、中、高劑量活血消癭方均可促進(jìn)大鼠甲狀腺細(xì)胞纖維抑制亡，并且小劑量活血消癭方作用最為顯著。見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠甲狀腺凋亡細(xì)胞比例（±s）

表2 各組大鼠甲狀腺凋亡細(xì)胞比例（±s）

3 討論

化裁消癭方組成：夏枯草12 g、柴胡9 g、半夏9 g、莪術(shù)9 g、郁金6 g、白術(shù)9 g、茯苓12 g、甘草6 g進(jìn)行治療，目前己發(fā)現(xiàn)有多種評(píng)價(jià)細(xì)胞增殖的方法，其中PCNA是最常用的指標(biāo)之一[13]。在細(xì)胞核內(nèi)存在可溶性與不溶性2種PCNA，可溶性PCNA在細(xì)胞周期各期中均有表達(dá)，不溶性PCNA較穩(wěn)定，一般作為評(píng)價(jià)細(xì)胞增殖狀態(tài)的一個(gè)指標(biāo)。

結(jié)節(jié)性甲狀腺腫的發(fā)病機(jī)制尚不清楚[14]，目前認(rèn)為可能與甲狀腺細(xì)胞的增殖和凋亡失去平衡有關(guān)[15]。PCNA是目前己發(fā)現(xiàn)的最常用的評(píng)價(jià)細(xì)胞增殖的方法。在實(shí)驗(yàn)性大鼠甲狀腺腫模型中，PCNA較正常對(duì)照組相比，表達(dá)明顯增強(qiáng)，在去掉致甲狀腺腫因素后，隨著甲狀腺重量的減輕，PCNA的表達(dá)也逐漸減弱，此結(jié)果與本實(shí)驗(yàn)相符。