不同蛋白酶對(duì)紅娘魚蛋白水解物的結(jié)構(gòu)特性和生物活性的影響

胡學(xué)佳，戴志遠(yuǎn)，金仁耀，張曉頔，董 燁

（浙江工商大學(xué)海洋食品研究院 杭州 310035）

隨著現(xiàn)代化捕撈技術(shù)的推廣普及，大中型魚類被大量捕獲，導(dǎo)致生物鏈中的小雜魚迅速繁殖起來(lái)[1]。2020 年世界水產(chǎn)總量達(dá)2.14 億t，其中小雜魚占捕撈量的49%[2]。如何處理這些量大質(zhì)低的漁獲物成為長(zhǎng)期困擾水產(chǎn)加工業(yè)的主要問(wèn)題。紅娘魚為小雜魚的典型代表，具有體型小，生長(zhǎng)繁殖速度快，蛋白質(zhì)含量豐富等特點(diǎn)，其主要被制作成生魚粉，用以水產(chǎn)養(yǎng)殖和陸地畜禽養(yǎng)殖[1]，然而，由于加工技術(shù)落后，產(chǎn)品不僅得率和附加值低，還造成了嚴(yán)重的環(huán)境污染。近年來(lái)，越來(lái)越多的人開(kāi)始利用生物活性肽改善身體健康或輔助治療慢性疾病。海洋蛋白源成為開(kāi)發(fā)生物活性肽的原料寶庫(kù)，這也為解決雜魚利用問(wèn)題提供了新思路。

21 世紀(jì)是研究開(kāi)發(fā)生物活性肽的黃金時(shí)代，各種具有特殊功效的活性肽被從不同食物蛋白質(zhì)中分離出來(lái)，這些生物活性肽通常是由2～20 個(gè)氨基酸組成的短氨基酸鏈[3]，并具有各種活性，其中抗氧化活性和降血壓活性最受關(guān)注[4-5]?？寡趸目捎行б种谱杂苫钚?，人體內(nèi)的自由基容易與DNA、RNA、脂質(zhì)和蛋白質(zhì)反應(yīng)并破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，從而造成各種疾病[6]。有研究表明，癌癥、冠心病和阿爾茨海默氏癥與體內(nèi)自由基有一定關(guān)系[7]，因此抗氧化肽成為研究生物活性肽的重點(diǎn)。高血壓影響著全世界約30%的成年人[8]，其與心血管疾病，如心力衰竭、心肌梗死和過(guò)早死亡均有關(guān)系，每年因高血壓死亡的人數(shù)高達(dá)940 萬(wàn)之多[9]。血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（ACE）抑制劑是治療高血壓最有效的方法[10]。目前臨床常用的ACE 抑制劑有依那普利、賴諾普利、福辛普利等，然而其副作用明顯，如炎癥反應(yīng)和皮膚疹等[11]。從食物蛋白水解物中獲得高效安全的ACE 抑制劑受到人們的追捧。

制備生物活性肽的方法主要分為直接提取法、化學(xué)合成法和酶解法3 種。直接提取法產(chǎn)物產(chǎn)率低，費(fèi)時(shí)費(fèi)力且難以產(chǎn)業(yè)化；化學(xué)合成法操作復(fù)雜、成本昂貴；酶法水解法反應(yīng)條件溫和、可控、產(chǎn)物產(chǎn)率高且能耗低，是提取蛋白質(zhì)水解物最常用的方法。目前很多蛋白酶均被用于制備生物活性肽，例如：木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶、胃蛋白酶、中性蛋白酶、復(fù)合蛋白酶等。在酶解過(guò)程中，不同蛋白酶會(huì)特異性識(shí)別不同的酶切位點(diǎn)，釋放出不同序列、大小和功能的多肽。因此蛋白酶的選擇是影響酶解產(chǎn)物生物活性最主要的因素。

本研究以紅娘魚為原料，利用木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶和復(fù)合蛋白酶對(duì)其進(jìn)行酶解，分析不同蛋白酶對(duì)水解產(chǎn)物的影響，包括其分子結(jié)構(gòu)變化情況，如分子質(zhì)量和二級(jí)分子結(jié)構(gòu)組成等，以及其生物活性的變化，如ACE抑制活性和抗氧化活性，以期為紅娘魚的多元化生產(chǎn)應(yīng)用中提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.2 儀器與設(shè)備

E2695 高效液相色譜，美國(guó)Waters 公司；HITACHI L－8900 氨基酸全自動(dòng)分析儀，日本日立公司；EVOLUTION 60S 紫外分光光度計(jì)，美國(guó)Thermo Fisher 公司；DSHZ-300A 旋轉(zhuǎn)式恒溫振蕩器，太倉(cāng)市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠；400Y多功能粉碎機(jī)，永康市鉑歐五金制品有限公司；Fresco 21 冷凍高速離心機(jī)，美國(guó)Thermo Fisher 公司；DGG-9123A 電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；QL-8bb-253 旋渦振蕩器，海門市其林貝爾儀器制造有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 紅娘魚蛋白水解物的制備 將新鮮紅娘魚去除魚骨、魚皮及其結(jié)締組織。將魚肉切成小塊并使用絞肉機(jī)攪碎，冷凍干燥至恒重并粉碎成粉末。向225 mL 蒸餾水中加入30 g 魚肉粉，然后以8 000 r/min 均質(zhì)60 s 后，分別以8 000 U/g 的比例加入木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、復(fù)合蛋白酶、堿性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶。酶解過(guò)程中通過(guò)0.1 mol/L HCl 和NaOH 來(lái)保持酶解液的最佳pH。反應(yīng)結(jié)束后，95 ℃加 熱10 min 滅 酶，8 000 r/min 離 心10 min。取上清液冷凍干燥并儲(chǔ)存在-20°C，待用。

1.3.2 分子質(zhì)量分布 根據(jù)蔣騰川等[12]的方法測(cè)定分子質(zhì)量分布，并稍作修改。利用高效液相色譜儀測(cè)定紅娘魚水解物的分子質(zhì)量分布。其中，色譜柱 為TSKgel G2000-SWx1（7.8 mm×300 mm，Tosoh），檢測(cè)器為UV/Vis，進(jìn)樣量10 μL，流動(dòng)相由體積比為45∶55 的A 液和B 液組成，其中A 液為乙腈，B 液為0.1%TFA，等度洗脫，流速0.5 mL/min。待測(cè)樣品質(zhì)量濃度為10 mg/mL，0.45 μm 的濾膜過(guò)濾，按照上述分析條件進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)校準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品相對(duì)分子質(zhì)量及其分布范圍。稱取適量標(biāo)準(zhǔn)品抑肽酶（6 500 u）、細(xì)胞色素C（12 400 u）、碳酸酐酶（29 000 u）和HHL（429 u）配制成質(zhì)量濃度為5 mg/mL 的溶液，進(jìn)行檢測(cè)并繪制標(biāo)準(zhǔn)品譜圖。

1.3.3 氨基酸組成 稱取樣品10～20 mg，加入6 mL/min 鹽酸，110 ℃水解24 h，制得水解液，將其過(guò)濾離心，用自動(dòng)氨基酸分析儀L-8900 型分析上清液的氨基酸組成[13]。

1.3.4 水解物結(jié)構(gòu)表征

1.3.4.1 紫外全波長(zhǎng)掃描 將待測(cè)樣品用0.01 mol/L PBS（pH 7.0）配制為1.0 mg/mL 的溶液，將其加入狹縫比色皿至體積的2/3，在掃描波長(zhǎng)200～500 nm，采樣間隔1 nm 的條件下進(jìn)行紫外全波長(zhǎng)掃描[14]。

1.3.4.2 傅里葉變換紅外（FTIR）光譜 稱取10 mg 的樣品粉末與0.1 g 的KBr 混合研磨放入模具中，利用油壓機(jī)加壓成透明薄片，在掃描范圍400～4 000 cm-1，分辨率4 cm-1的采集條件下測(cè)定傅里葉變換紅外光譜，并使用Omnic 和Peakfit 軟件處理譜圖[15]。

1.3.4.3 內(nèi)源熒光光譜測(cè)定 將樣品溶解于0.01 mol/L pH 7.0 的PBS 中，制得質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL 的溶液，進(jìn)行熒光光譜測(cè)定。熒光光譜的分析參數(shù)為激發(fā)波長(zhǎng)290 nm，掃描波長(zhǎng)范圍300～500 nm，狹縫寬度5 nm[16]。

1.3.5 ACE 抑制率測(cè)定 取40 μL 的樣品溶液，與100 μL 6.5 mmol/L HHL 混合均勻并于37 ℃孵育10 min，隨后加入20 μL 的ACE，混合均勻并于37 ℃反應(yīng)30 min，最后加入85 μL 的1 mol/L鹽酸，終止反應(yīng)，用0.45 μm 濾膜過(guò)濾，制得最終反應(yīng)產(chǎn)物，于HPLC 系統(tǒng)自動(dòng)進(jìn)樣分析[17]。色譜條件：色譜柱SunFire C18（4.6 mm × 250 mm，5 μm）；檢測(cè)器UV/Vis；進(jìn)樣量10 μL；流動(dòng)相70%TFA 水溶液（0.1%，V/V）-30%乙腈，流量為0.8 mL/min，按式（1）計(jì)算ACE 抑制率：

式中，A——用純水代替酶解物參與反應(yīng)條件下所產(chǎn)生的HA 的峰面積（mAU·min）；B——酶解物參與反應(yīng)的條件下所產(chǎn)生的HA 的峰面積（mAU·min）。

1.3.6 抗氧化活性測(cè)定

1.3.6.1 ·OH 清除能力的測(cè)定 采用水楊酸法測(cè)定不同蛋白酶水解物的·OH 清除能力。取0.1 mL樣品分別加入0.05 mL 的9 mmol/L FeCl2溶液和9 mmol/L 水楊酸-乙醇溶液，最后加入0.05 mL 8.8 mmol/L H2O2溶液?jiǎn)?dòng)反應(yīng)，振蕩混勻后于37℃條件下，反應(yīng)30 min，測(cè)定510 nm 波長(zhǎng)處的吸光值[14]。根據(jù)式（2）計(jì)算·OH 清除率：

式中，A1——樣品的吸光值；A2——50 μL 超純水代替FeCl2溶液測(cè)得的吸光值；A3——200 μL 超純水代替樣品溶液測(cè)得的吸光值。

1.3.6.2 DPPH 自由基清除率的測(cè)定 取1.5 mL樣品溶液與DPPH 溶液（1 mL，1 mmol/L，溶于95%乙醇）混合均勻，室溫反應(yīng)30 min，于517 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光值。樣品的吸光度越低說(shuō)明其自由基清除率越高[18]。根據(jù)式（3）計(jì)算DPPH 自由基清除率：

式中，A1——樣品的吸光度；A2——95%乙醇與樣品反應(yīng)的吸光度；A3——蒸餾水與DPPH 溶液反應(yīng)的吸光度。

1.3.6.3 Fe2+螯合活性的測(cè)定 取3.7 mL 樣品溶液與FeCl2溶液（0.1 mL，20 mmol/L）混勻，室溫反應(yīng)3 min，加入Ferrozine（0.2 mL 5 mmol/L）已停止反應(yīng)，室溫孵育10 min 后，在562 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光值[19]。根據(jù)式（4）計(jì)算Fe2+螯合活性：

式中，A1——樣品的吸光值；A2——超純水代替樣品溶液測(cè)得的吸光值。

1.4 數(shù)據(jù)處理

每組試驗(yàn)重復(fù)3 次，將試驗(yàn)結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差”表示，使用Design Expert 8.0 和Origin 2017 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 分子質(zhì)量分布

圖1a 是標(biāo)準(zhǔn)品相對(duì)分子質(zhì)量分布圖，其標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=-0.2025x+6.8751，R2=0.9758。5種蛋白酶水解產(chǎn)物的分子質(zhì)量分布如圖1b 所示。對(duì)照組的分子質(zhì)量91.06%分布在〉10 000 u 的范圍內(nèi)，與其相比，酶解后的分子質(zhì)量分布范圍顯著下降。研究表明，低分子質(zhì)量肽比高分子質(zhì)量肽具有更強(qiáng)的生物活性[17]，因此分子質(zhì)量分布〈1 000 u范圍的肽段較其它分子質(zhì)量的肽段生物活性要高。如圖1 所示，木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、復(fù)合蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶和堿性蛋白酶水解產(chǎn)物中〈1 000 u 的分子質(zhì)量分布比例分別為33.29%，59.11%，66.11%，65.9%，88.2%。綜上所述，堿性蛋白酶水解產(chǎn)物中低分子質(zhì)量肽所占比例最多，推測(cè)紅娘魚蛋白中含有大量堿性蛋白酶特異識(shí)別的序列。根據(jù)酶解產(chǎn)物的分子質(zhì)量分布，紅娘魚蛋白的酶解效率從大到小依次為堿性蛋白酶〉風(fēng)味蛋白酶〉復(fù)合蛋白酶〉中性蛋白酶〉木瓜蛋白酶。

2.2 氨基酸組成

水解物的氨基酸組成直接影響其生物活性。不同酶水解產(chǎn)物的氨基酸含量如表1 所示，不同蛋白酶水解產(chǎn)物的氨基酸含量差異顯著，對(duì)照組氨基酸含量為393.47 mg/g，木瓜、中性、堿性、復(fù)合和風(fēng)味蛋白酶組的氨基酸含量分別為521.743，528.2，551.524，539.705，492.53 mg/g，試驗(yàn)組的氨基酸含量明顯高于對(duì)照組，試驗(yàn)組又以堿性蛋白酶組氨基酸含量最高，堿性蛋白酶的切割位點(diǎn)有廣泛特異性，可水解紅娘魚蛋白釋放大量的氨基酸。蛋白酶種類不同其切割位點(diǎn)也會(huì)發(fā)生變化，因此水解產(chǎn)物中氨基酸的組成和含量也有所不同，其中堿性蛋白酶酶解產(chǎn)物中芳香族氨基酸（51.66 mg/g）、疏水性氨基酸（200.50 mg/g）含量較高，芳香族氨基酸是影響抗氧化能力的關(guān)鍵因素之一[20]，疏水性氨基酸被認(rèn)為顯著提高ACE 抑制率[21]。

表1 不同蛋白酶水解產(chǎn)物的總氨基酸組成Total 1 Amino acid compositions of hydrolysates with different proteinases

2.3 水解物結(jié)構(gòu)表征

2.3.1 紫外全波長(zhǎng)掃描 用紫外光譜法檢測(cè)了不同蛋白酶水解物，其吸收光譜如圖2a 所示。6 組樣品在275 nm 波長(zhǎng)附近均有吸收峰，未處理、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、堿性蛋白酶和復(fù)合蛋白酶組最大吸收峰值分別為0.63，0.81，0.93，0.84，0.97，0.86。有研究表明，Tyr 和Trp 的吸收峰在280 nm 附近[22]，而各組酶解產(chǎn)物的峰值波長(zhǎng)均小于280 nm，說(shuō)明部分Tyr、Trp 與水解產(chǎn)物中肽形成了偶聯(lián)雙鍵，增加了275 nm 波長(zhǎng)附近的紫外吸收。Tyr 和色氨酸經(jīng)常存在于蛋白質(zhì)的疏水內(nèi)部[23]，酶解過(guò)程通過(guò)暴露更多的疏水基團(tuán)，改變了水解物的最大吸收波長(zhǎng)偏移。堿性蛋白酶組的吸光度強(qiáng)度顯著高于其它組，這表明蛋白酶不同則其酶切位點(diǎn)不同，進(jìn)而影響酶解產(chǎn)物的一級(jí)結(jié)構(gòu)。

圖2 紅娘魚酶解產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)特征Fig.2 The structural characteristics of Lepidotrigla microptera hydrolysates

2.3.2 內(nèi)源熒光光譜 熒光光譜主要用來(lái)反映蛋白質(zhì)中芳香族氨基酸的含量，通過(guò)測(cè)定水解產(chǎn)物中色氨酸殘基在348 nm 波長(zhǎng)處產(chǎn)生熒光強(qiáng)度的變化來(lái)反映不同蛋白酶水解產(chǎn)物三級(jí)結(jié)構(gòu)的變化。如圖2b 是不同蛋白酶水解產(chǎn)物的熒光光譜，熒光強(qiáng)度由大到小是堿性蛋白酶組〉中性蛋白酶組〉木瓜蛋白酶組〉風(fēng)味蛋白酶組〉復(fù)合蛋白酶組〉未處理組。堿性蛋白酶水解液的熒光強(qiáng)度均高于其它組，說(shuō)明堿性蛋白酶水解物有更多的蛋白分子結(jié)構(gòu)展開(kāi)并將包埋在蛋白中的色氨酸殘基暴露在水解液中，同時(shí)有更多蛋白酶結(jié)合位點(diǎn)顯露出來(lái)，導(dǎo)致酶解速度加快。

2.3.3 傅里葉變換紅外（FTIR）光譜 FTIR 可以直觀的反映待測(cè)物質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)，光譜圖中的吸收峰和分子中各官能團(tuán)振動(dòng)相對(duì)應(yīng)[24]。5 種蛋白酶水解產(chǎn)物在4 000～400 cm-1范圍內(nèi)的特征吸光度帶如圖3 所示。6 組樣品在范圍3 650～3 200 cm-1內(nèi)均有吸收峰，其中對(duì)照組和木瓜蛋白酶水解物的峰形最寬，說(shuō)明其分子聚合物中可能存在大量的分子內(nèi)或分子間氫鍵力[25]。對(duì)照組在2 926 cm-1有一條吸收帶，這由-CH 拉伸振動(dòng)產(chǎn)生。不同蛋白酶水解物在2 938 cm-1處均有一條吸收帶，說(shuō)明脂肪鏈的組成發(fā)生了變化，這表明在酶水解過(guò)程中，水解物內(nèi)部的疏水區(qū)發(fā)生了變化。

圖3 紅娘魚酶解物的傅里葉變換紅外（FTIR）分析光譜Fig.3 Fourier transform infrared（FTIR）spectroscopy of Lepidotrigla microptera hydrolysates

通過(guò)軟件分析不同蛋白酶水解產(chǎn)物的二級(jí)結(jié)構(gòu)組成，結(jié)果如表2 所示。與對(duì)照組相比，經(jīng)不同蛋白酶處理后各組水解產(chǎn)物的β-轉(zhuǎn)角比例均增加且所占比例較高，分別是57.13%（木瓜蛋白酶）、56.09%（中性蛋白酶）、62.58%（復(fù)合蛋白酶）、69.68（堿性蛋白酶）和61.76（風(fēng)味蛋白酶），各組水解產(chǎn)物的α-螺旋比例降低分別為19.67%（木瓜蛋白酶）、18.73%（中性蛋白酶）、18.65%（復(fù)合蛋白酶）、16.62%（堿性蛋白酶）和17.11%（風(fēng)味蛋白酶）。各組蛋白酶水解物的二級(jí)結(jié)構(gòu)中β-轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)則卷曲所占比例均有所增加，且是主要組成部分。Yong 等[26]報(bào)道β-轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)則卷曲與α-螺旋和β-折疊相比穩(wěn)定性及結(jié)構(gòu)緊密性較差，這說(shuō)明蛋白酶破壞了紅娘魚蛋白的有序結(jié)構(gòu)，進(jìn)而使分子結(jié)構(gòu)疏松開(kāi)放。堿性蛋白酶組β-轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)則卷曲是各組中所占比例最高的，因此堿性蛋白酶更容易和紅娘魚蛋白結(jié)合，從而水解出更多生物活性肽。

2.4 ACE 抑制率

為了研究紅娘魚酶解產(chǎn)物的ACE 抑制率，本研究在樣品不同濃度下檢測(cè)ACE 抑制率，由表3可知，ACE 抑制率與樣品濃度成正相關(guān)，既ACE抑制率隨著樣品濃度的增大而增加。ACE 抑制活性從大到小依次為堿性蛋白酶組〉中性蛋白酶組〉復(fù)合蛋白酶組〉風(fēng)味蛋白酶組〉木瓜蛋白酶組，其IC50分別為0.77，0.98，1.4，1.8，2.31 mg/mL。

表3 紅娘魚酶解產(chǎn)物的ACE 抑制活性Table 3 ACE inhibitory activity of Lepidotrigla microptera hydrolysates

2.5 抗氧化活性

以·OH 清除能力、DPPH 自由基清除率的測(cè)定和Fe2+螯合活性為指標(biāo)評(píng)價(jià)紅娘魚水解產(chǎn)物的體外抗氧化活性。如圖4 所示，6 組樣品的抗氧化能力與其濃度呈正比例增長(zhǎng)，其中堿性蛋白酶組的抗氧化活性顯著高于其它組，其·OH 清除能力、DPPH 自由基清除率和Fe2+螯合活性的IC50值分別為1.88，1.92，1.76 mg/mL。分析原因是堿性蛋白酶的酶切位點(diǎn)是C 末端疏水氨基酸，使大量疏水氨基酸暴露出來(lái)，因此其抗氧化活性高于其它組。Zhang 等[27]以鰱魚鰭為原料，利用胰蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶和木瓜蛋白酶對(duì)其進(jìn)行酶解，結(jié)果發(fā)現(xiàn)堿性蛋白酶產(chǎn)物具有顯著的Fe2+螯合活性；Sinthusamran 等[28]將鮭魚骨酶解后，堿性蛋白酶水解物的抗氧化活性和水解度顯著優(yōu)于其它組，這與本研究結(jié)果相一致。風(fēng)味蛋白酶的抗氧化活性最低，表明其對(duì)紅娘魚蛋白特異性較低。

3 結(jié)論

本研究以紅娘魚為原料，研究5 種蛋白酶水解產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)特性、抗氧化活性和ACE 抑制活性。堿性蛋白酶水解物的低分子質(zhì)量占比最高，疏水氨基酸含量最高，并且比其它組具有更強(qiáng)的抗氧化活性和ACE 抑制活性。綜上所述，堿性蛋白酶水解紅娘魚制備生物活性肽可以作為功能性食品的潛在成分，此外，可分離純化探索與抗氧化活性和ACE 抑制活性相關(guān)的肽序列，進(jìn)一步研究其作用機(jī)制。