酶聯(lián)免疫法測(cè)定大豆中赭曲霉毒素A

馮莉

摘要：赭曲霉毒素A易溶于水和小蘇打溶液，并且于極性有機(jī)溶劑中化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定不易發(fā)生反應(yīng)。值得注意的是，赭曲霉毒素A具有較強(qiáng)的耐熱性，烘烤只能使其毒性減少1/5，而水煮或者水蒸也不能破壞其毒性。有研究者對(duì)赭曲霉毒素A的耐熱性做了研究，以半數(shù)存活量及50%有效性發(fā)現(xiàn)赭曲霉毒素A對(duì)熱因素比較穩(wěn)定，100～200℃間沒(méi)有發(fā)現(xiàn)完全分解。檢測(cè)赭曲霉毒素A常用的方法有很多，現(xiàn)介紹的酶聯(lián)免疫法（ ELISA）則具有檢測(cè)速度快、靈敏度高、準(zhǔn)確性強(qiáng)、可以方便準(zhǔn)確的定量、操作相對(duì)簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，得到了快速發(fā)展和廣泛的應(yīng)用。

關(guān)鍵詞：酶聯(lián)免疫法；赭曲霉毒素A；大豆；真菌毒素

中圖分類號(hào)：S565.1

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B

文章編號(hào)：2095-9737（2018）08-0026-01

赭曲霉毒素是糧食真菌毒素污染的主要品種之一，赭曲霉毒素由赭曲霉和青霉菌污染大豆、玉米等飼料原材料及其他農(nóng)副產(chǎn)品后所產(chǎn)生的一種具有強(qiáng)烈毒性的有害代謝物質(zhì)。赭曲霉毒素產(chǎn)生速度快，存在范圍廣，許多菌種都可以產(chǎn)生赭曲霉毒素A，常用的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)赭曲霉毒素A的方法很多，包括薄層色譜層析法（ TLC）、高效液相色譜法（HPLC），現(xiàn)主要介紹的是酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）。

1 儀器試劑

試劑：氯化鈉；氯化鉀；磷酸二氫鉀；十二水磷酸氫二鈉；吐溫20；檸檬酸鈉；檸檬酸；四甲基聯(lián)苯胺；過(guò)氧化氫（30%）；濃硫酸（98%）；赭曲霉毒素A標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)；抗抗體；包被有抗抗體的48孔微孔板；赭曲霉毒素A單克隆抗體；赭曲霉毒素A酶標(biāo)抗原；儀器：美國(guó)biorad680型酶標(biāo)儀；實(shí)驗(yàn)粉碎機(jī)；微量移液器；多空能旋轉(zhuǎn)混合器；渦旋混合器；電子天平（0.01 g）；20目標(biāo)準(zhǔn)篩。

以上藥品未特殊注明的均為分析純，水為一級(jí)水。

2 實(shí)驗(yàn)原理

酶聯(lián)免疫分析法（ ELISA）結(jié)合了抗原抗體的特異性免疫反應(yīng)和酶的高效催化顯色反應(yīng)。用提取液即甲醇與水的混合溶液（70%甲醇+30%蒸餾水）將粉碎后的大豆樣品中赭曲霉毒素A提取出來(lái)，經(jīng)過(guò)一系列過(guò)濾稀釋后用酶標(biāo)儀外標(biāo)法測(cè)定赭曲霉毒素A的含量。

3 溶液配制

提取液：甲醇與水的混合溶液（70%甲醇+30%蒸餾水）；稀釋液：甲醇與水的混合溶液（5%甲醇+95%蒸餾水）；洗滌液：氫氧化鈉40.0 g+氯化鉀1.0 g+磷酸二氫鉀1.o g+十二水磷酸氫二鈉14.5 g；吐溫2.5 mL加蒸餾水徹底溶解并定容至500 mL，使用時(shí)稀釋10倍；赭曲霉毒素A稀釋緩沖液：氯化鈉8.0 g+氯化鉀0.2 g+磷酸二氫鉀0.2 g+十二水磷酸氫二鈉2.9 g用蒸餾水溶解并定容至1000 mL備用；檸檬酸緩沖溶液：檸檬酸鈉10.15 g+檸檬酸13. 76 g用蒸餾水溶解并定容至1000 mL備用；底物溶液甲：稱取0.4g四甲基聯(lián)苯胺用檸檬酸緩沖溶液溶解并定容至1000 mL備用；底物溶液乙：用移液器準(zhǔn)確移取1.5 mL過(guò)氧化氫（30%）用檸檬酸緩沖溶液定容至1000 mL備用；反應(yīng)終止液：移取濃硫酸（98%）22.2 mL緩慢加入到177.8 mL蒸餾水中。

4 樣品處理

將大豆樣品用四分法分取500 g，全部粉碎并使其全部透過(guò)20目篩，混合后用電子天平準(zhǔn)確稱取5.OO g待測(cè)樣品于50 mL離心管中，隨后加入25 mL提取液，擰緊蓋子后置于多功能旋轉(zhuǎn)混合器中充分混合10 min，用高速定性濾紙過(guò)濾后，用微量移液器準(zhǔn)確移取濾液200 μL于1.5 mL離心管中，再加入200 μL配置好的赭曲霉毒素A稀釋緩沖液，在渦旋混合器上渦旋混勻30 s，作為待測(cè)溶液備用。

5 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制及樣品檢測(cè)

5.1 樣品檢測(cè)

將微孔條插入酶標(biāo)板的相應(yīng)位置，分別加入50 μL待測(cè)溶液于微孔中，記錄加樣位置。再各加入50 μL赭曲霉毒素A酶標(biāo)抗原，隨后再加入50 μL赭曲霉毒素A抗體溶液，在酶標(biāo)板上加好板蓋，使反應(yīng)在常溫下進(jìn)行40 min；之后將板孔中液體全部棄去后，用洗滌液洗板4次，保證洗滌徹底后用吸水紙吸干殘余液體。之后再在孔中分別加入150 μL顯色底物溶液，反應(yīng)15 min后加入終止液50 μL終止顯色反應(yīng)，最后置于酶標(biāo)儀中以630 nm為參比，測(cè)定450 nm處吸光度。

5.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

用赭曲霉毒素A標(biāo)準(zhǔn)品和甲醇配制濃度為100 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，再用稀釋液（5%甲醇溶液）配制濃度為O ng/mL、0.2 ng/mL、0.5 ng/mL、1.O ng/mL、2.O ng/mL、5.0 ng/mL的赭曲霉毒素A標(biāo)準(zhǔn)序列溶液，經(jīng)過(guò)與樣品提取溶液相同的處理后，用酶標(biāo)儀測(cè)定其450 nm處的吸光度，以赭曲霉毒素A濃度的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，吸光度的百分值為縱坐標(biāo)繪制外標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。用樣品溶液測(cè)得的吸光度值與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較定量。

6 結(jié)論

該方法相對(duì)于高效液相色譜法有特異性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，較薄層色譜法具有定量準(zhǔn)確等優(yōu)勢(shì)，在檢測(cè)量大，對(duì)定量的靈敏度以及準(zhǔn)確度有較高要求的實(shí)驗(yàn)中，有較強(qiáng)的實(shí)用性。