黑色素瘤模型的建立與評價

姚香利 苗旭光 魏茜茜 王暄 劉守信

摘 要：為了快速有效地進(jìn)行在體藥物篩選，研究了以小鼠黑色素實(shí)體瘤組織中的原代細(xì)胞構(gòu)建黑色素瘤模型的方法。從荷黑色素瘤小鼠的組織中提取原代腫瘤細(xì)胞，與體外培養(yǎng)的B16細(xì)胞通過皮下注射分別植入兩組C57BL/6小鼠體內(nèi)，考察兩組小鼠腫瘤顯現(xiàn)時間和生長速度。結(jié)果表明：當(dāng)接種濃度為5.0×106個/ mL、每只0.2 mL時，小鼠黑色素瘤原代細(xì)胞和體外培養(yǎng)的B16細(xì)胞成瘤率分別為100%和80%，且小鼠右前肢腫瘤（大小約4 mm3）出現(xiàn)時間分別約在第3天和第8天。紫杉醇對兩種模型的初步評價顯示，與體外培養(yǎng)的B16細(xì)胞模型相比，原代B16細(xì)胞模型是體內(nèi)篩選和評價特定化合物抗腫瘤活性的一種可行而有效的方法，成瘤時間較短、成瘤率高，所得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)誤差也較小。模型的建立為相關(guān)藥物評價模型的開發(fā)研究提供了一條可借鑒的新途徑。

關(guān)鍵詞：分子藥理學(xué)；黑色素瘤；原代細(xì)胞；C57BL/6小鼠；B16細(xì)胞；接種濃度

中圖分類號：R332；R730.5 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1008-1542（2018）04-0343-06doi：10.7535/hbkd.2018yx04008

Abstract：In order to screen drug rapidly and effectively in vivo， the approach of the establishment for mouse melanoma model with primary cell from melanin solid tumor tissue of mouse is studied. The primary cell and the cultured B16 cells in vitro are implanted into two groups of C57BL/6 mice by hypodermic， respectively. The appearing time and the growth rate of tumor in two groups of mouse are investigated. The results show that when the inoculation is 0.2 mL for each one （the cell concentration of 5.0×106/mL）， the tumor formation rates of the primary tumor cells of mouse melanoma and in vitro cultured B16 cells are 100% and 80%， respectively， and it takes about 3 and 8 days respectively that the tumor sizes become about 4 mm3. The preliminary evaluation of two models are carried out with taxol， showing that the primary B16 cell model is a feasible and effective method for screening and evaluating the antitumor activity of specific compounds in vivo compared with the B16 cell model cultured in vitro， and it has shorter tumor forming time， higher tumor forming rate and less error in the obtained experimental data， which provides a new way for the development and research of related drug evaluation models.

Keywords：molecular pharmacology； melanoma； primary cell； C57BL/6 mice； B16 cell； inoculation density

惡性黑色素瘤是起源于神經(jīng)嵴的黑色素細(xì)胞惡性腫瘤[1]。統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，在美國，惡性黑色素瘤的年發(fā)病人數(shù)為88 000人左右，且每小時就有一名惡性黑色素瘤患者失去生命[2]。惡性黑色素瘤的發(fā)病率逐年增高[3]，全球各地區(qū)均呈持續(xù)增長趨勢[4]。外科手術(shù)治療中，Ⅰ期、Ⅱ期黑色素瘤患者5年生存率正從80%下降到55%[5-7]。因此，針對治療惡性黑色素瘤藥物的研發(fā)已經(jīng)成為本領(lǐng)域研究的重點(diǎn)之一。人類利用小鼠模型進(jìn)行癌癥研究已有110多年的歷史[8]。藥物的研發(fā)效率常常依賴于動物腫瘤模型的優(yōu)劣。孟星君等[9]和王淑瑞等[10]在小鼠黑色素瘤模型的建立中均采用將體外培養(yǎng)的小鼠黑色素瘤細(xì)胞B16接種于小鼠皮下的方法。

河北科技大學(xué)學(xué)報2018年第4期姚香利，等：黑色素瘤模型的建立與評價本文通過對比小鼠黑色素瘤組織中提取的原代腫瘤細(xì)胞和體外培養(yǎng)B16細(xì)胞兩種方法所建立的小鼠黑色素瘤動物模型的差異，優(yōu)選建立更高效的黑色素瘤模型方法，從而為研究黑色素瘤治療藥物的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)提供便利途徑。以C57BL/6小鼠為實(shí)驗(yàn)動物，選取不同濃度的小鼠黑色素瘤B16細(xì)胞，在小鼠皮下建立腫瘤模型，優(yōu)選出最佳的細(xì)胞接種濃度；同時，以最佳接種濃度接種從組織中提取的原代腫瘤細(xì)胞和體外培養(yǎng)的B16細(xì)胞，于兩組小鼠右前肢腋窩皮下接種后，觀察各組小鼠腫瘤顯現(xiàn)時間、腫瘤生長速度，以優(yōu)選出建立小鼠黑色素瘤動物模型的最佳方法。在此基礎(chǔ)上，用臨床使用的抗腫瘤藥物紫杉醇對所建立的模型進(jìn)行了初步評價。

1 主要儀器與材料

CO2培養(yǎng)箱（3131），美國Thermo公司提供；低速離心機(jī)（5418），德國Eppendorf公司制造。

C57BL/6小鼠，雄性，6～7周齡，17～20 g，SPF級，由河北省實(shí)驗(yàn)動物中心（河北醫(yī)科大學(xué)）提供。

B16小鼠黑色素瘤細(xì)胞株，由中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物研究所提供；胎牛血清，購自Bovogen Biologicals Pty Ltd；胰蛋白酶，購自Gibco公司；紫杉醇，購于廣州愛純醫(yī)藥科技和西安康諾化工有限公司；細(xì)胞完全培養(yǎng)基：將45 mL RPMI-1640（Gibco）+5 mL胎牛血清+500 μL（雙抗青霉素100 U/mL和鏈霉素100 mg/L）充分混勻，用于培養(yǎng)細(xì)胞，將細(xì)胞置于37 ℃、5%（體積分?jǐn)?shù)，下同）CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 小鼠黑色素瘤B16細(xì)胞模型的建立

取對數(shù)生長期B16細(xì)胞，用PBS洗滌2次，用胰蛋白酶進(jìn)行消化，胎牛血清終止，輕輕吹打混勻，收集細(xì)胞懸浮液。將上述懸浮液置于離心機(jī)內(nèi)，以1 000 r/min轉(zhuǎn)速離心5 min，棄去上清液。加入1 mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基，輕輕吹打成單細(xì)胞懸浮液，以臺盼藍(lán)染色，活細(xì)胞數(shù)在95%以上。用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，用PBS調(diào)整細(xì)胞濃度，細(xì)胞濃度約為5.0×105，5.0×106，5.0×107個/mL。取C57BL/6小鼠30只，隨機(jī)平均分為3組，即低濃度組（5.0×105個/mL）、中濃度組（5.0×106個/mL）和高濃度組（5.0×107個/mL），每只接種0.2 mL。用75%的酒精擦拭小鼠右前肢腋窩處進(jìn)行消毒，取已經(jīng)調(diào)整好濃度的小鼠黑色素瘤B16細(xì)胞，接種于相對應(yīng)的各組小鼠右前肢腋窩皮下，每日觸摸小鼠右前肢，觀察是否有腫瘤塊出現(xiàn)，并隔天記錄腫瘤的生長情況。

2.2 原代腫瘤細(xì)胞小鼠黑色素瘤模型的建立

首先剝離小鼠皮下的腫瘤塊，選擇光滑的腫瘤組織，用PBS洗滌。將處理后的腫瘤組織放到培養(yǎng)皿中，加入少量PBS，去除結(jié)締組織和血管組織。用眼科剪將組織剪碎，用胰蛋白酶進(jìn)行消化，以1 000 r/min轉(zhuǎn)速離心5 min，棄去上清液，分別加入到放有完全培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，于培養(yǎng)箱內(nèi)孵育過夜，貼壁細(xì)胞為較純的原代細(xì)胞。將細(xì)胞用 PBS洗滌2次，用胰蛋白酶進(jìn)行消化，胎牛血清終止，輕輕吹打混勻，收集細(xì)胞懸浮液[11]。將此懸浮液置于離心機(jī)內(nèi)，以1 000 r/min轉(zhuǎn)速離心5 min，棄去上清液。加入1 mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基，輕輕吹打成單細(xì)胞懸浮液，以臺盼藍(lán)染色，活細(xì)胞數(shù)在95%以上，采用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，用PBS調(diào)整細(xì)胞濃度為最佳接種濃度，即5.0×106個/mL。

2.3 原代腫瘤細(xì)胞與體外培養(yǎng)B16細(xì)胞小鼠黑色素瘤模型平行接種實(shí)驗(yàn)

取C57BL/6小鼠20只，隨機(jī)平均分為2組。用75%的酒精擦拭小鼠右前肢腋窩處進(jìn)行消毒。第1組接種小鼠黑色素瘤B16細(xì)胞，濃度為5.0×106/mL，每只接種0.2 mL；第2組接種小鼠黑色素瘤原代細(xì)胞，濃度為5.0×106個/mL，每只0.2 mL。每日觸摸小鼠右前肢，觀察是否有腫瘤塊出現(xiàn)，并記錄每天腫瘤的生長情況。

2.4 紫杉醇對兩種小鼠黑色素瘤模型的評價

體外培養(yǎng)細(xì)胞組和原代腫瘤細(xì)胞組建模方法同“2.1”和“2.2”，每組10只C57BL/6小鼠，每組接種小鼠黑色素腫瘤細(xì)胞后，觀察小鼠右前肢腋窩皮下。發(fā)現(xiàn)小鼠右前肢有腫瘤（大小約4 mm3）出現(xiàn)時，視為腫瘤顯現(xiàn)時間。次日，以臨床使用的紫杉醇為抗腫瘤藥物，采用腹腔注射方法給藥，劑量為10 mg/kg[12]，周期為21天。重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)，考察兩組小鼠腫瘤的變化情況。

2.5 觀察指標(biāo)

觀察并記錄小鼠的精神狀態(tài)、飲食、毛色，以及腫瘤外觀的形態(tài)情況。接種后每日觸摸小鼠右前肢腋下，考察腫瘤顯現(xiàn)時間、腫瘤生長速度。將出現(xiàn)約4 mm3的腫瘤塊時間視為腫瘤顯現(xiàn)時間，每日用游標(biāo)卡尺記錄腫瘤的最長徑L（mm）、垂直方向最大橫徑W（mm）、腫瘤體積V（mm3），計(jì)算公式為V=LW2/2[13]。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理，計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，各組間比較采用t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，其中差異P<0.05視為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果與討論

黑色素瘤的致死率非常高，細(xì)胞也易于轉(zhuǎn)移。為了篩選出合理的治療藥物，建立快速、有效的黑色素瘤動物模型已成為相關(guān)研究的重點(diǎn)之一。裸鼠免疫功能缺陷、存活率低，對操作環(huán)境的要求比較嚴(yán)格，且價格相對較為昂貴[14]。而小鼠相對來說在這些方面具有較為明顯的優(yōu)勢。所以，在藥物初步篩選期間，選擇小鼠黑色素瘤作為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷姆桨冈诩夹g(shù)上和經(jīng)濟(jì)上是可行的。原代細(xì)胞取自新鮮剝離的腫瘤組織，其生物學(xué)特性尚未發(fā)生較明顯的變化，仍保留原二倍體遺傳性，基因保留量在90%以上，因而更適用于藥物敏感性試驗(yàn)，所得數(shù)據(jù)更具有說服力[15-17]。

參照已報道的文獻(xiàn)＼[18—22＼]，本實(shí)驗(yàn)采用胰蛋白酶消化法處理腫瘤標(biāo)本，剔除基質(zhì)纖維、間質(zhì)蛋白等組織間質(zhì)，充分分散組織細(xì)胞，以保證在短時間內(nèi)生長成片，獲得較高產(chǎn)量、較高純度的原代細(xì)胞。

3.1 小鼠荷瘤后狀態(tài)考察

隨著B16細(xì)胞接種數(shù)的不同，C57BL/6小鼠的腫瘤生長速度也不同。接種數(shù)越多，腫瘤顯現(xiàn)時間越早，腫瘤生長越快，小鼠的基本狀況越差。高濃度組接種后，約在第5天小鼠出現(xiàn)腫瘤塊，其精神狀態(tài)良好，毛色潔白，食物攝入量正常。第6～12天，腫瘤增長迅速，小鼠右前肢腫瘤周邊脫毛嚴(yán)重，腫瘤周邊可見血管，小鼠精神萎靡，食物攝入量減少。第13～20天，部分小鼠腫瘤塊有滲血或出血現(xiàn)象。隨著時間的延長，小鼠精神恍惚，幾乎不進(jìn)食水。中濃度組接種后，小鼠約在第8天出現(xiàn)腫瘤塊，第9～12天，小鼠精神狀態(tài)尚可，食物攝入量正常，腫瘤生長速度緩慢。第13～20天，小鼠精神狀態(tài)不如之前，食物攝入量減少，毛色不潔，腫瘤增長速度加快。相對于高、中濃度組，低濃度組腫瘤生長緩慢，小鼠基本情況較好，出現(xiàn)精神不佳、毛色不潔、飲食量減少等情況的時間段推后。原代腫瘤細(xì)胞接種小鼠皮下后，約在第3天出現(xiàn)腫瘤塊；第4～7天小鼠精神狀態(tài)尚可，食物攝入量正常，腫瘤生長速度緩慢；第8～20天，小鼠精神狀態(tài)萎靡，食物攝入量減少，腫瘤塊增長速度明顯。

3.2 B16細(xì)胞接種濃度對腫瘤形成和生長的影響

接種腫瘤細(xì)胞濃度的變化，不僅影響著實(shí)體瘤顯現(xiàn)的時間，同時也影響著成瘤率。選擇低、中、高3個濃度組對小鼠腫瘤生長情況進(jìn)一步考察，其組別間差異P<0.01。不同濃度B16細(xì)胞接種小鼠皮下實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1。

表1數(shù)據(jù)表明，接種數(shù)目越多，腫瘤顯現(xiàn)時間越早，成瘤率越高。圖1是不同接種濃度條件下，實(shí)體瘤體積隨時間的變化曲線。圖1數(shù)據(jù)顯示：低濃度組腫瘤出現(xiàn)時間最晚，腫瘤生長速度較為緩慢；中劑量組腫瘤生長速度較平穩(wěn)；高劑量組腫瘤出現(xiàn)時間最早，腫瘤生長速度快。其中，相對于低濃度組，中濃度組腫瘤出現(xiàn)的時間較早，成瘤率能達(dá)到80%。同時，中濃度組腫瘤增長的速度較為平穩(wěn)，更便于考察被測化合物對實(shí)體腫瘤增長的影響。對于高濃度組，小鼠腫瘤增長的速度過快，在第18天時腫瘤體積約為4 000 mm3，考慮到動物理論學(xué)而放棄，停止實(shí)驗(yàn)。所以，確定中濃度組的接種細(xì)胞數(shù)為最佳接種濃度。

3.3 B16原代細(xì)胞與體外培養(yǎng)細(xì)胞接種成瘤率的比較

在優(yōu)選出接種濃度的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步對B16原代細(xì)胞與體外培養(yǎng)細(xì)胞接種成瘤率進(jìn)行了考察。選取1.0×106個細(xì)胞為接種濃度，同時接種于小鼠腋窩皮下，腫瘤顯現(xiàn)時間及成瘤率見表2（P<0.01）。

表2數(shù)據(jù)顯示：在給定接種濃度下，體外培養(yǎng)的B16細(xì)胞在約第8天出現(xiàn)腫瘤塊，成瘤率可達(dá)80%。而接種原代細(xì)胞后，約在第3天發(fā)現(xiàn)腫瘤塊，成瘤率可達(dá)100%?？梢?，原代細(xì)胞接種成瘤效果優(yōu)于體外細(xì)胞接種。

3.4 最佳接種濃度條件下腫瘤的生長

在最佳接種濃度下，將體外培養(yǎng)的B16細(xì)胞和小鼠黑色素瘤原代細(xì)胞接種于小鼠皮下，考察實(shí)體瘤在兩組小鼠體內(nèi)的生長情況，數(shù)據(jù)如圖2所示。由圖2實(shí)體瘤增長曲線可知，與接種體外培養(yǎng)B16細(xì)胞相比，接種原代細(xì)胞的小鼠黑色素實(shí)體瘤的生長速度較快，成瘤率較高，但兩組的腫瘤生長速度均較為平穩(wěn)。

3.5 建模方法評價

為了更進(jìn)一步考察兩種模型在藥物篩選中應(yīng)用的可行性以及特點(diǎn)，研究中選擇目前臨床上使用的抗腫瘤藥物紫杉醇測試了所建模型。接種體外培養(yǎng)B16細(xì)胞和原代B16細(xì)胞于小鼠皮下，按常規(guī)選取成瘤后的小鼠，將其隨機(jī)分為兩組，平行各選10只，編號從1到10，腹腔注射紫杉醇。在給藥期間，小鼠均沒有死亡現(xiàn)象。給藥21天后，觀察各組小鼠的腫瘤體積大小?？紤]到小鼠個體差異性，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果基本相似，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)如圖3所示。

由圖3可知，紫杉醇能夠抑制黑色素瘤的增大，但似乎藥物對兩組小鼠體內(nèi)腫瘤抑制的效果存在一定的差異，主要表現(xiàn)為各小鼠實(shí)體瘤體積相差較大。其中，原代腫瘤細(xì)胞組的各小鼠腫瘤體積相對差異不大，數(shù)據(jù)平行性較好。相反，體外培養(yǎng)細(xì)胞組的各小鼠腫瘤體積大小的波動性較大。藥物篩選是一項(xiàng)系統(tǒng)而嚴(yán)謹(jǐn)?shù)难芯抗ぷ鳎瑪?shù)據(jù)的真實(shí)性和穩(wěn)定性對判定化合物的藥用價值十分重要。相對于體外培養(yǎng)細(xì)胞模型，原代B16細(xì)胞模型在篩選和評價特定化合物的抗腫瘤活性方面，數(shù)據(jù)誤差較小，便于得出相對準(zhǔn)確的評價。

4 結(jié) 論

1）選用體外培養(yǎng)的B16細(xì)胞，在低、中、高3個不同濃度下接種于C57BL/6小鼠皮下，優(yōu)選出中濃度為優(yōu)勢腫瘤模型的接種濃度。

2）在中濃度基礎(chǔ)上，將體外培養(yǎng)的B16細(xì)胞和原代腫瘤細(xì)胞分別同時接種于小鼠皮下，數(shù)據(jù)顯示，原代細(xì)胞的小鼠黑色素實(shí)體瘤生長速度較快，成瘤率較高，但兩組的腫瘤生長速度均較為平穩(wěn)。

3）選擇紫杉醇藥物來評價所建模型的效果，結(jié)果顯示，兩種模型均可應(yīng)用于藥物的篩選，在療程內(nèi)未發(fā)現(xiàn)有小鼠死亡的現(xiàn)象。但在觀察實(shí)體瘤的變化時發(fā)現(xiàn)，原代細(xì)胞腫瘤模型組的小鼠腫瘤體積在施藥后21天時，彼此差異相對較?。欢谑┧幱?jì)量、施藥時間等所有條件相同的情況下，體外培養(yǎng)細(xì)胞模型組小鼠的腫瘤體積彼此相差較大。

4）原代B16細(xì)胞模型是體內(nèi)篩選和評價特定化合物抗腫瘤活性的一種可行而有效的方法，成瘤時間較短、成瘤率高，所得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)誤差也較小，為相關(guān)藥物評價模型的開發(fā)研究提供了一條可借鑒的新途徑。

5）本實(shí)驗(yàn)只做了小鼠黑色素瘤模型，今后尚需對其他腫瘤模型的建立開展更進(jìn)一步的研究。

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