異養(yǎng)硝化一好氧反硝化細(xì)菌的篩選及其脫氮性能研究

張婷月 丁鈺 黃民生

摘要：為尋求高效水體脫氮手段，從龍泓澗梯級(jí)塘底泥中篩選出以Pseudomonas菌屬為主、具有異養(yǎng)硝化一好氧反硝化功能菌群，將其命名為LHJ-1.異養(yǎng)硝化和好氧反硝化性能研究結(jié)果表明，菌群LHJ-1具有明顯的異養(yǎng)硝化功能，對NH+4-N和TOC利用率分別達(dá)99.90%和56.69%，且表現(xiàn)出較高的反硝化能力，對NO-3-N和NO-2-N的轉(zhuǎn)化率分別為92.46%和89.67%.由不同環(huán)境因素（碳氮比、碳源、pH值和溶解氧）影響實(shí)驗(yàn)可知，多種環(huán)境因子均對菌群LHJ-1脫氮效果具有較大影響，因此在實(shí)際應(yīng)用中需考察不同環(huán)境因子，以找出最佳生長條件，獲得最大脫氮效率.異養(yǎng)硝化一好氧反硝化菌群LHJ-1的篩選在水體脫氮除碳中具有廣闊的應(yīng)用前景.

關(guān)鍵詞：異養(yǎng)硝化;好氧反硝化;混合菌;脫氮性能

中圖分類號(hào)：X522 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A DOI：10.3969/j.issn.1000-5641.2018.06.003

引言

近年來水生態(tài)環(huán)境問題日益嚴(yán)重，水中氮素污染狀況不斷惡化，氮素超標(biāo)已成為水體富營養(yǎng)化的一個(gè)重要原因.因此去除水中氮素已經(jīng)成為水污染防治領(lǐng)域的一個(gè)熱點(diǎn)問題生物脫氮以無污染、高效率的優(yōu)點(diǎn)被認(rèn)為是脫除水中氮素的有效手段傳統(tǒng)的生物脫氮分為硝化過程和反硝化過程.自養(yǎng)硝化細(xì)菌將水中NH+4-N在好氧條件下氧化為NO-3-N和NO-2一N，反硝化細(xì)菌在缺氧的環(huán)境下還原NO-3--N成氮?dú)?，從而脫除水中氮元?由于反應(yīng)條件和作用機(jī)理不同，硝化和反硝化過程需分開進(jìn)行，導(dǎo)致工藝流程耗時(shí)較長.因此科學(xué)家希望能夠突破傳統(tǒng)生物脫氮技術(shù)限制，發(fā)掘新型脫氮方法.1984年，Robertson等人發(fā)現(xiàn)了一種能以NO-3一N和氧氣同時(shí)作為電子受體的兼養(yǎng)微生物Thiosphaera Pantotropha，并將此過程命名為好氧反硝化.這一發(fā)現(xiàn)突破了傳統(tǒng)生物脫氮理論，此后陸續(xù)有學(xué)者對好氧反硝化領(lǐng)域展開研究.目前被報(bào)道出的好氧反硝化菌屬有產(chǎn)堿桿菌屬（alcaligenes）[9]、假單胞菌屬（Pseudomonas）、芽孢桿菌屬（Bacillus）和紅球桿菌屬（Rhodococcus）等.綜合分析好氧反硝化作用機(jī)理的不同觀點(diǎn)，總結(jié)起來可以從微環(huán)境和生物學(xué)角度進(jìn)行析分.前者認(rèn)為在微生物絮體內(nèi)，由于氧傳遞導(dǎo)致絮體內(nèi)產(chǎn)生溶解氧濃度梯度，在外部環(huán)境中與空氣接觸良好的好氧反硝化菌進(jìn)行硝化作用，在絮體內(nèi)部存在厭氧的微環(huán)境，由厭氧菌進(jìn)行反硝化作用.后者認(rèn)為好氧反硝化過程中的協(xié)同呼吸，使得氧和NO-3一N可同時(shí)作為電子受體此外，在好氧條件下，膜內(nèi)硝酸鹽還原酶幾乎不起作用，而周質(zhì)硝酸還原酶能夠在高濃度溶解氧條件下表達(dá)，參與完成反硝化過程.較傳統(tǒng)的生物脫氮而言，好氧反硝化菌能夠同時(shí)進(jìn)行硝化和反硝化，縮短工藝流程，且具有較好的耐高溶解氧性能，能夠利用原水中的碳源完成自身代謝活動(dòng)，生長速率快.

本實(shí)驗(yàn)從龍泓澗梯級(jí)塘底泥中富集出具有異養(yǎng)硝化一好氧反硝化功能的細(xì)菌菌群，討論了其異養(yǎng)硝化及好氧反硝化生理生化特征，并研究了不同因素（碳源、碳氮比、pH值和溶解氧）對其脫氮效能的影響，以期為實(shí)際工程應(yīng)用提供技術(shù)借鑒.

1材料與方法

1.1樣品采集

龍泓澗梯級(jí)塘位于杭州西湖西南面，采用彼得森抓泥斗采集底部沉積物，隨后迅速冷藏運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室.

1.2培養(yǎng)基

2結(jié)果與討論

2.1菌群鑒定

細(xì)菌生物多樣性檢測是基于對16SrDNA功能基因等特定區(qū)域片段PCR產(chǎn)物進(jìn)行高通量測序，來探究物種的群落組成和進(jìn)化關(guān)系.高通量測序結(jié)果表明（如圖1所示），LHJ-1為混合菌群，在屬水平上主要由Pseudomonas（74.34%）、Cupriavidus（2.79%）、Acidovorax（10.44%）、Acinetobacter（11.09%）和Pseudoduganella（1.16%）構(gòu)成，其中假單胞菌屬（Pseudomonas）占比最大，成為優(yōu)勢菌.假單胞菌屬是典型的好氧反硝化菌，這表明經(jīng)過長時(shí)間的富集和馴化，菌群LHJ-1已成為由好氧反硝化菌主導(dǎo)的功能群落.

不同菌屬的細(xì)菌混合生長，物種多樣性豐富，提高了系統(tǒng)的穩(wěn)定性，菌種之間的協(xié)同共生作用，在實(shí)際應(yīng)用中具有更好的環(huán)境適應(yīng)性，更有利于水中氮素和有機(jī)物的脫除.

2.2菌群LHJ-1的異養(yǎng)硝化特性

異養(yǎng)菌較自養(yǎng)菌而言，可利用環(huán)境中的有機(jī)碳源維持自身生長，生長速率快，細(xì)胞產(chǎn)量高，同時(shí)達(dá)到降解有機(jī)物的目的.本文為了考察LHJ-1的異養(yǎng)硝化性能，將其接種至以NH4C1為唯一氮源、丁二酸鈉為碳源的培養(yǎng)基中，結(jié)果如圖2所示.

0-6h內(nèi)細(xì)菌處于適應(yīng)期，生長較為緩慢.6-18 h細(xì)菌處于對數(shù)增長階段，細(xì)菌量迅速增加，OD600值從0.008增長至0.112.與此同時(shí)，碳源濃度也迅速下降，從113.175 mg/L下降至30.353mg/L，平均降解速率為4.601mg/（L.h），降解率為73.18%.由此可見，細(xì)菌利用了大量外部碳源來供自身生長，具有明顯的異養(yǎng)功能.NH+4一N濃度在0-6 h內(nèi)迅速下降，從最初3.081mg/L降至0.003 mg/L，去除率達(dá)99.90%，而后趨于穩(wěn)定.細(xì)菌生長與NH-4一N的去除存在一個(gè)滯后過程，可能是由于菌體先吸收氮源和碳源后需要一個(gè)利用轉(zhuǎn)化過程，此現(xiàn)象與康鵬亮研究一致.TN的去除主要集中在細(xì)菌的對數(shù)生長階段，從Oh到18 h，TN去除率達(dá)83.04%，最大去除率在第30小時(shí)，達(dá)到93.58%.隨后細(xì)菌生長進(jìn)入衰亡期，TOC和TN

3結(jié)論

從龍泓澗梯級(jí)塘底泥中篩選出具有異養(yǎng)硝化好氧反硝化功能的菌群LHJ-1，主要包含Pseudomonas、Cupriavidus、Acidovorax、Acinetobacter和Pseudoduganella，其中Pseu-domonas占比最大.異養(yǎng)硝化特性探究結(jié)果表明，菌群LHJ-1對NH+4一N和TN的最大去除率分別為99.90%和93.58%，具有較強(qiáng)的異養(yǎng)硝化功能.好氧反硝化性能研究中，菌群LHJ-1對NO-3-N和NO-2N的最大去除率分別為92.46%和89.67%，具有明顯的好氧反硝化性能.研究還進(jìn)一步證實(shí)，多種環(huán)境因子對菌群LHJ-1的脫氮效率影響顯著.環(huán)境因子影響實(shí)驗(yàn)表明，菌群LHJ-1發(fā)揮異養(yǎng)硝化一好氧反硝化功能的最佳c/N為16，最佳碳源為葡萄糖，最佳pH值范圍為5-9，最佳通氧轉(zhuǎn)速為60～120r/min，在對應(yīng)的培養(yǎng)條件下，菌群LHJ-1達(dá)到了較高的脫氮效率.

該菌擬用于處理生活污水的厭氧/好氧（A/O）工藝中.生活污水中COD通常在300～400mg/L，較高的在500 mg/L左右，NH+4一N濃度在30mg/L左右.由上述結(jié)果可知，當(dāng)c/N為16時(shí)TN去除效果最高，而實(shí)際應(yīng)用中原水很難達(dá)到較高的c/N，這可能導(dǎo)致碳源不足，從而降低處理效果.因此在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中需加強(qiáng)對LHJ-1的馴化，使其能夠適應(yīng)較低的c/N條件，并取得較好的脫氮效果.