釀造醬油中10種單體酚酸成分的檢測分析

張露　梁寒峭　劉偉

摘要[目的]建立一種可以同時檢測10種酚酸含量的高效液相分析方法。[方法]以無添加特級釀造醬油和普通特級釀造醬油、三級醬油為研究對象，分析總多酚和單體酚酸種類與含量。[結果]該方法操作簡便，準確度和重復性好。3個樣品的酚酸種類相似，無添加特級醬油的總酚酸含量為251.870 mg/L，顯著高于普通特級醬油（109.655 mg/L）和三級醬油（42.461 mg/L），其中兒茶素、香草酸、咖啡酸和阿魏酸4種單體酚酸含量顯著高于普通特級醬油和三級醬油。[結論]酚酸類成分的組成和含量分析可為釀造醬油品質研究提供更全面的評價思路。

關鍵詞釀造醬油；總酚酸；單體酚酸；高效液相

中圖分類號TS207.3文獻標識碼

A文章編號0517-6611（2018）25-0172-04

Detection and Analysis of Ten Monomeric Phenolic Acids in Fermented Soy Sauce

ZHANG Lu1，LIANG Hanqiao1，2，LIU Wei3 et al

（1.China National Research Institute of Food and Fermentation Industries，China Center of Industrial Culture Collection，Beijing 100015；2.Dean of Biomedical School，Beijing City University，Beijing 100094；3.Liaocheng Zhengxin Ecological Agricultural Science and Technology Parks Co.，Ltd，Liaocheng，Shandong 252000）

Abstract[Objective] The research aimed to establish an analysis method of 10 kinds of phenolic acids by HPLC.[Method]Taking no added special grade soy sauce，ordinary special grade soy sauce and No.3 soy sauce as research object，the type and content of total polyphenols and monomeric phenolic acids were analyzed.[Result]The methods were convenient with high recovery rate，good repeatability and accuracy.There was no difference of the total polyphenol contents and phenolic acids species among three samples.However，total phenolic acids content of no added special grade soy sauce was 251.870 mg/L，which was significantly higher than that of ordinary special grade soy sauce （109.655 mg/L） and No.3 soy sauce （42.461 mg/L）.Content of catechinic acid，vanillic acid，caffeic acid and ferulic acid in no added special grade soy sauce were significantly higher than that of ordinary special grade soy sauce and No.3 soy sauce.[Conclusion]The composition and content analysis of phenolic acids can provide a more comprehensive evaluation of the quality of fermented soy sauce.

Key wordsFermented soy sauce；Total phenolic acid；Monomeric phenolic acid；High performance liquid phase

釀造醬油是以大豆和/或脫脂大豆、小麥和/或麩皮為原料，經(jīng)微生物發(fā)酵制成的具有特殊色、香、味的液態(tài)調味品[1]。隨著人類社會的進步和社會經(jīng)濟的不斷發(fā)展，人們的生活水平也越來越高，調味方式的改變也逐漸成為健康飲食的要素之一，人們從片面追求色、香、味的傳統(tǒng)調味方式轉而向講究原色、原汁、原味的現(xiàn)代健康調味方式[2-3]。目前在我國，無添加釀造醬油產(chǎn)品暫無相關標準，市場較為混亂，名稱繁多，但其含義均應指原料經(jīng)微生物發(fā)酵結束后，不再使用任何食品配料、食品添加劑等進行調配，制備而成的調味品。無添加釀造醬油類產(chǎn)品配料中只含有大豆或脫脂大豆、小麥和（或）麩皮、食鹽等原料，不含有白砂糖、酵母提取物等食品配料，以及甜味劑（三氯蔗糖、安賽蜜等）、增鮮劑（谷氨酸鈉、5′-肌苷酸二鈉、5′-鳥苷酸二鈉等）、防腐劑（苯甲酸鈉、山梨酸鉀等）、焦糖色素等食品添加劑[4]。因此，對于無（零）添加醬油來說，發(fā)酵過程中自然代謝產(chǎn)生的多酚類物質和小分子酚酸對其風味、色澤和營養(yǎng)均具有重要意義。

酚類物質是谷物中自然存在的一類具有比較明確的生理活性和藥用價值的成分，與人體健康密切相關。釀造醬油和食醋的主要原料大豆和小麥中富含此類活性物質，在經(jīng)過多區(qū)系復雜微生物的長期發(fā)酵酶解，大分子難吸收的酚類物質轉化為易吸收的小分子多酚和酚酸成分[5-8]，對釀造醬油食品的風味及健康作用均具有重要的研究價值。筆者建立了一種快速、簡單可同時檢測10種酚酸含量的高效液相色譜分析方法，為醬油類食品的酚類研究提供參考。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1試材。樣品材料1由山東正信生態(tài)農(nóng)業(yè)科技園有限公司提供，樣品材料2和3均購自北京超市，具體信息見表1。

1.1.2試劑。

甲醇（色譜純），美國Fisher公司；其余試劑均為分析純；水為實驗室自制超純水（18 MΩ·cm）；酚酸標準品（對香豆酸、阿魏酸、香草酸、芥子酸、丁香酸、咖啡酸、沒食子酸、對羥基苯甲酸、兒茶素、綠原酸）均購自Sigma公司，純度95%以上。

1.1.3儀器與設備。

Thermo UltiMate 3000型高效液相色譜儀（VWD-3000紫外檢測器，Chromeleon 7色譜工作站，ThermoFisher公司）；Centrifuge 5804R離心機（Eppendorf公司）；Pultton P200紫外可見分光光度計（美國寶騰公司）；十萬分之一天平。

1.2方法

1.2.1樣品處理。

精密吸取1.0 mL樣品，加入1 mL 鹽酸溶液（1∶1）混勻后，再加入5 mL乙酸乙酯振蕩30次，靜置取上層水層，重復3次合并水層后加入400 μL氫氧化鈉水溶液（1.0 mol/L），混勻后50 ℃以下減壓蒸干后，以初始流動相定容至1 mL，用濾膜過濾，取續(xù)濾液備用。

1.2.2標準溶液的配制。

分別稱取沒食子酸等10種酚酸標準品（10.0～20.0 mg）用甲醇溶解并轉移至棕色容量瓶中，配制成0.80～1.50 mg/mL終濃度的標準貯備液封口低溫保存?zhèn)溆茫褂们案鶕?jù)試驗需要將此標準貯備液用甲醇稀釋至適宜含量使用。

1.2.3色譜條件。

Thermo Acclaim 120 C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；柱溫40 ℃；流速1.0 mL/min；進樣量10～50 μL；流動相：A甲醇，B 1.5%乙酸水溶液；檢測波長280、320 nm。洗脫程序：0～5 min，B為96%～89%；5～22 min，B為89%等度；22～23 min，B為89%～96%；23～50 min，B為96%等度；50～52 min，B為96%～74%；52～77 min，B為74%等度；77～80 min，B為74%～0%。

2結果與分析

2.1檢測波長

對10種酚酸標準品溶液進行全波長掃描，結果顯示，各組分均在280和320 nm處有較大吸收，其中沒食子酸、咖啡酸、綠原酸和對香豆酸在280和320 nm處吸收強度差異不大，對羥基苯甲酸、兒茶素、香草酸和丁香酸280 nm處吸收更強，反之阿魏酸和芥子酸在320 nm處吸收更強。綜合考慮，選取280 nm 作為檢測波長為宜，在保留時間65～75 min時選用320 nm波長檢測。

2.2流動相的優(yōu)化由于該研究的檢測目標成分酚酸均具有至少一個酚羥基或羧基，此類結構在水中易產(chǎn)生電離，極性增強，導致液相色譜峰拖尾嚴重，分離度差。因此考慮加入酸性調節(jié)劑改善拖尾現(xiàn)象。前期研究表明乙酸作為調節(jié)劑可顯著改善酚酸類成分的拖尾[9]，提高分離度，分別考察了體積分數(shù)為0.1%、0.5%、1.0%、1.5%和2.0%的酸濃度，結果顯示酸含量越高分離度越好，考慮色譜柱壽命故選擇1.5%體積濃度的乙酸水溶液和甲醇作為流動相，最終達到10種酚酸標準品和樣品目標成分的基線分離（圖1）。

2.3標準曲線的建立

分別配制0.08～200.00 mg/L 5個系列濃度的酚酸混合標準溶液，進樣10 μL，按照“1.2.3”條件測定，以峰面積（y）為縱坐標、質量濃度（x）為橫坐標，計算得到10條標準曲線，結果見表2。由表2可見，10種酚酸標準品溶液濃度和檢測響應值呈良好的線性關系，并且檢測限都較低，說明此方法靈敏度較好。

安徽農(nóng)業(yè)科學2018年

2.4精密度、重復性、穩(wěn)定性和加標回收試驗

向已知酚酸含量的樣品中定量添加混標溶液，按照“1.2.1”項條件平行制備樣品6份，按照“1.2.3”條件測定含量，計算回收率；同一樣品連續(xù)進樣6次計算精密度；6份樣品分別進樣計算重復性；同一樣品分別于0、20、40、60、80和100 min時間點進樣計算穩(wěn)定性。結果（表3）顯示，各酚酸的回收率均在80%以上，精密度和重復性的RSD值均小于3%，說明此方法的準確性較高；穩(wěn)定性RSD值均小于4%，說明在100 min內10種酚酸物質均較穩(wěn)定。

2.5樣品的檢測

1號樣品為無添加特級釀造醬油，2號為普通特級釀造醬油，3號為普通三級釀造醬油。從表4可看出，2款特級醬油均檢測到8種酚酸，三級醬油只檢測到7種酚酸成分；1號樣品的總酚酸含量顯著高于2號和3號樣品，分別是其總含量的2.3倍和5.9倍。所有檢測到的酚酸中，1號樣品的兒茶素、香草酸、咖啡酸和阿魏酸含量顯著高于2號和3號樣品；芥子酸顯著高于2號樣品，與3號樣品差異不顯著；1號和2號樣品的對羥基苯甲酸、丁香酸和對香豆酸顯著低于3號樣品。釀造醬油樣品中兒茶素含量最高，其次為香草酸和丁香酸，沒食子酸和綠原酸均未檢測到。

3討論

釀造醬油作為我國家庭廚房使用頻次最高的一種發(fā)酵類調味品，其風味和質量的高低與人民的食品安全與健康息息相關。目前國內大多數(shù)醬油產(chǎn)品均為“加料醬油”，谷氨酸鈉（味精主要成分）、5′-肌苷酸二鈉和5′-鳥苷酸二鈉（雞精主要成分）、焦糖色、苯甲酸鈉等調味劑和防腐劑是常見的添加劑。我國作為醬油和醋的生產(chǎn)和消費大國，高端營養(yǎng)的醬油產(chǎn)品種類卻寥寥無幾。現(xiàn)今普遍認知無添加釀造醬油口感寡淡，相比“加料醬油”，具有鮮味不足、偏咸偏澀、口感不夠協(xié)調、單薄留口短等缺點[3]。

醬油的口感是由游離氨基酸、有機酸、單雙糖、酚酸等成分綜合構成，經(jīng)過前期研究發(fā)現(xiàn)，除添加的谷氨酸外，無添加的特級醬油中13種氨基酸含量均高于普通特級醬油[10]，且分布更均衡，鮮味不單一，營養(yǎng)更全面。該研究中發(fā)現(xiàn)無添加的特級醬油總多酚含量與普通特級醬油無明顯差異，而總酚酸和4種單體酚酸含量均顯著高于普通特級醬油，這可能與其更長期的發(fā)酵工藝相關。由于無添加醬油只能通過更徹底地發(fā)酵釋放更多的游離氨基酸才能達到特級醬油的氨基酸態(tài)氮標準，而普通醬油可以通過外添加谷氨酸鈉和酵母提取物等達到標準，因此推測無添加特級醬油的發(fā)酵周期可能更長。其主要原料之一的小麥中富含酚酸類成分，但在原料中主要以結合的形式存在，經(jīng)過長周期的發(fā)酵釋放的游離酚酸含量也越高。多種類的酚酸從口感角度可以調和醬油的咸度，更重要的是賦予其健康營養(yǎng)。由于酚酸類物質多具有酚羥基或苯烯結構，已證實生理活性廣泛且易吸收[11]，如咖啡酸具有清除自由基、拮抗內皮素的活性，從而起到雙重保護血管內皮、調節(jié)血管舒張收縮正常的作用[12]；阿魏酸具有增強造血機能、抗心肌缺血和預防輻射損傷等作用[13]。亦有研究表明[14]，葡萄酒預防心腦血管疾病的活性與酚酸具有相關性，其含有的酚酸種類與釀造醬油相似，陳建業(yè)等[14]研究3款國產(chǎn)干紅的總酚酸含量均在60 mg/L左右，高于普通三級醬油，但遠低于特級醬油，干白的酚酸含量則更低。目前尚無從酚酸角度對不同級別醬油的系統(tǒng)研究和全面評價，在這方面的研究有待深入，為釀造醬油的質量控制和評價提供新思路。

該研究建立了一種同時測定醬油中10種酚酸含量的高效液相色譜分析方法，試驗結果表明該方法操作簡便、準確度和重復性好。3個樣品的酚酸種類相似，無添加特級釀造醬油的總酚酸含量顯著高于普通特級釀造醬油和三級醬油。

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