不同品系金銀花質(zhì)量評(píng)價(jià)

譚政委　夏偉　許蘭杰

摘要[目的]評(píng)價(jià)不同品系金銀花藥材質(zhì)量。[方法]采用HPLC和紫外分光光度法測(cè)定相同產(chǎn)地5個(gè)不同品系金銀花藥材成分綠原酸、蘆丁、木犀草苷、異綠原酸A、異綠原酸C、木犀草素和總黃酮的含量，采用方差分析、相關(guān)性及主成分分析方法對(duì)5個(gè)品系金銀花成分間的差異及相關(guān)性進(jìn)行評(píng)價(jià)。[結(jié)果]相關(guān)性分析中，綠原酸與木犀草苷，異綠原酸A與異綠原酸C，異綠原酸A和異綠原酸C與總黃酮均呈現(xiàn)顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.648、0.833、0.690和0.636；異綠原酸A和異綠原酸C與木犀草素，蘆丁和木犀草素與總黃酮均呈顯著負(fù)相關(guān)，其相關(guān)系數(shù)分別為-0.081、-0.688、-0.476和-0.595。主成分分析綜合評(píng)價(jià)中豫金2號(hào)（YJE）金銀花評(píng)分較高，其次為豫封3號(hào)（YFS）金銀花，評(píng)分中排序最低的為由山東引種的北花1號(hào)（BHYH）金銀花。[結(jié)論]通過(guò)對(duì)5個(gè)品系金銀花藥材內(nèi)在成分進(jìn)行評(píng)價(jià)，為金銀花藥材質(zhì)量的評(píng)價(jià)、指導(dǎo)金銀花規(guī)范化種植及新品系的選育提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞金銀花；內(nèi)在成分；質(zhì)量評(píng)價(jià)；主成分分析

中圖分類號(hào)R284文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)0517-6611（2018）25-0168-04

Quality Evaluation of Honeysuckle in Different Strains

TAN Zhengwei， XIA Wei， XU Lanjie et al

（Sesame Research Center， Henan Academy of Agricultural Sciences，Zhengzhou，Henan 450002）

Abstract[Objective] The research aimed to evaluate the quality of different strains of honeysuckle. [Method]HPLC and UV spectrophotometry were used to determine the contents of chlorogenic acid， rutin， Luteoloside， isochlorogenic acid A， isochlorogenic acid C， luteolin and total flavonoids in five different strains of honeysuckle in the same place.The differences and correlations between the five honeysuckle components were evaluated by analysis of variance， correlation and principal component analysis.[Result]In the correlation analysis，chlorogenic acid and mignonette glycosides， isochlorogenic acid A and isochlorogenic acid C， isochlorogenic acid A and total flavonoids ，isochlorogenic acid C and total flavonoids were significantly positive correlation，the correlation coefficients were 0.648， 0.833， 0.690 and 0.636， respectively；Isochlorogenic acid A and luteolin， isochlorogenic acid C and luteolin， rutin and total flavonoids， luteolin and total flavonoids were significant negative correlation，the correlation coefficients were -0.081，-0.688，-0.476 and -0.595， respectively. Through the main component analysis，the YJE score was higher， followed by YFS， and the lowest ranking in the score was BHYH.[Conclusion]By evaluating the internal components of five strains of honeysuckle medicinal materials， it provides a theoretical basis for the evaluation of the quality of honeysuckle medicinal materials， the standardization of honeysuckle planting and the breeding of new strains.

Key wordsHoneysuckle；Inner composition；Quality evaluation；Principal component analysis

金銀花為傳統(tǒng)大宗藥材之一，主要來(lái)源于忍冬科植物忍冬（Lonicera japonica Thunb.）的干燥花蕾或帶初開(kāi)的花[1]。忍冬史載于《肘后備急方》，首次以金銀花入藥記載于《救荒本草》[2-3]。傳統(tǒng)意義上金銀花具有清熱解毒、疏散風(fēng)熱等功效，主要應(yīng)用于風(fēng)熱引起的感冒。現(xiàn)代研究表明，金銀花主要含有揮發(fā)油類、黃酮類和有機(jī)酸類等成分，具有解熱抗炎、抗菌、抗病毒、抗氧化、保肝利膽等作用[4-5]。金銀花主產(chǎn)于我國(guó)河南、山東、河北等地，且以河南產(chǎn)“密銀花”“封丘金銀花”與山東產(chǎn)“濟(jì)銀花”較為道地[6]。根據(jù)對(duì)金銀花文獻(xiàn)查閱可知，不同品系、不同產(chǎn)地金銀花內(nèi)在質(zhì)量會(huì)有所不同。

長(zhǎng)期以來(lái)金銀花主要以人工栽培為主，品系的退化、病蟲(chóng)害的蔓延、產(chǎn)地的遷移、管理水平的不規(guī)范，使得金銀花品系退化、產(chǎn)量下降、質(zhì)量降低。提高金銀花的質(zhì)量及產(chǎn)量成為迫切需要。筆者以河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院現(xiàn)代農(nóng)業(yè)研究開(kāi)發(fā)基地（113°42′24″E，35°00′36″N）內(nèi)不同品系金銀花為研究對(duì)象，根據(jù)不同品系金銀花內(nèi)在活性成分及總黃酮為指標(biāo)進(jìn)行評(píng)價(jià)，優(yōu)選優(yōu)良品系金銀花，為更好地發(fā)展利用、保護(hù)金銀花種質(zhì)資源及選育金銀花新品系提供科學(xué)依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1試材。金銀花采自河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院現(xiàn)代農(nóng)業(yè)研究開(kāi)發(fā)基地，采用隨機(jī)定株采樣的方法，經(jīng)河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院梁慧珍研究院鑒定為忍冬科植物忍冬的干燥花蕾。樣品信息見(jiàn)表1。

1.1.2試劑。對(duì)照品綠原酸（東京化成工業(yè)株式會(huì)社，批號(hào)EBWZE-MS，純度>98.0%）；蘆?。▏?guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)20160725，純度>95%）；木犀草苷和木犀草素（aladdin，批號(hào)分別為J1624002、H1617004，純度>98%）；異綠原酸A和異綠原酸C（成都曼思特生物科技有限公司，批號(hào)分別為MUST-17030621、MUST-17021603，純度分別大于98.82%、99.84%）；色譜級(jí)甲醇（J.T.Baker）；色譜乙腈（J.T.Baker）；色譜甲醇（天津四友化學(xué)有限公司）；無(wú)水乙醇（天津四友化學(xué)有限公司，分析純）；無(wú)水三氯化鋁（天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司，分析純）；亞硝酸鈉（天津市大森化工產(chǎn)品銷售有限公司，分析純）；氫氧化鈉（天津市華東試劑廠，分析純）；純凈水為哇哈哈純凈水。

1.1.3儀器。Agilent 1260 型高效液相色譜儀（美國(guó)安捷倫公司，包括二元泵，自動(dòng)進(jìn)樣器，DAD 紫外檢測(cè)器）；美譜達(dá)UV-3200紫外分光光度計(jì)（上海美譜達(dá)儀器有限公司）；KQ3200DE數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2方法

1.2.1HPLC法測(cè)定活性成分[7-8]。

1.2.1.1色譜條件。

色譜柱為Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18 柱 （250 mm×4.6 mm，5 μm） ，流動(dòng)相為乙腈（B）-0.3%磷酸水溶液（A）；梯度洗脫：0～11 min，90～82A；11～30 min，82～80A；30～40 min，80A；40～50 min，80～75A；50～60 min，75～70A；體積流量1.0 mL/min，進(jìn)樣量10 μL，檢測(cè)波長(zhǎng)348 nm，柱溫30 ℃。

1.2.1.2混合對(duì)照品溶液制備。分別精密稱取綠原酸、蘆丁、木犀草苷、異綠原酸A、異綠原酸C和木犀草素對(duì)照品于10 mL棕色容量瓶中，用70%甲醇溶解并定容至刻度，得到各成分濃度分別為0.646、0.290、0.400、2.980、0.100、0.190 mg/mL的混合對(duì)照品溶液。

1.2.1.3供試品溶液制備。將金銀花樣品用電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱烘干，后將其粉碎、過(guò)篩后，稱取樣品粉末0.5 g于三角瓶中，加入25 mL 70%甲醇溶液，搖勻，超聲處理（功率150 W，頻率40 kHz）40 min，搖勻過(guò)濾，得供試品溶液。

1.2.1.4線性關(guān)系考察。

精密量取適量混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，加70%甲醇分別稀釋0、3、5、7、10、20倍，搖勻，分別按照“1.2.1.1”色譜條件依次進(jìn)樣，記錄色譜峰面積。以峰面積為縱坐標(biāo)（Y）、對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行線性回歸。

安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)2018年

1.2.1.5精密度試驗(yàn)。

精密吸取混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按“1.2.1.1”色譜條件將所得溶液經(jīng)0.22 μm有機(jī)微孔濾膜過(guò)濾后，連續(xù)進(jìn)樣6次、每次10 μL進(jìn)行測(cè)定，記錄峰面積并進(jìn)行計(jì)算。

1.2.1.6重復(fù)性試驗(yàn)。

精密稱取同一批金銀花樣品6份，按“1.2.1.3”方法平行制備成6份供試樣品溶液，按“1.2.1.1”色譜條件進(jìn)樣10 μL進(jìn)行測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算各成分的含量，然后計(jì)算RSD值。

1.2.1.7穩(wěn)定性試驗(yàn)。

精密稱取一份金銀花樣品，按“1.2.1.3”方法制備供試樣品溶液，按“1.2.1.1”色譜條件檢測(cè)，分別于0、4、8、16、24、32 h進(jìn)樣10 μL進(jìn)行測(cè)定，并記錄各成分峰面積，按照峰面積計(jì)算RSD。

1.2.1.8加樣回收率試驗(yàn)。

精密稱取已知6種成分含量的同一金銀花樣品6份，分別加入適量的6個(gè)成分標(biāo)準(zhǔn)品，并按照“1.2.1.3”方法制備供試樣品溶液，按“1.2.1.1”色譜條件進(jìn)樣10 μL進(jìn)行測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算加樣回收率。

1.2.2紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定總黃酮。

1.2.2.1金銀花提取液的制備。精確稱定金銀花粉末（過(guò)4號(hào)篩）0.25 g，加入50%的乙醇25 mL，50 ℃條件下超聲（150 W，40 kHz）浸提處理35 min后過(guò)濾，得到的澄清過(guò)濾液體即為金銀花提取液。

1.2.2.2總黃酮的測(cè)定及標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制[9]。以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)樣，用紫外分光光度計(jì)法測(cè)定金銀花提取物的總黃酮含量，在510 nm波長(zhǎng)處比色定量測(cè)定黃酮含量。具體步驟為：準(zhǔn)確稱取于120 ℃干燥至恒重的蘆丁0.020 7 g，用甲醇定容至100 mL，得濃度0.207 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液。準(zhǔn)確吸取標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL于6支具塞試管中，加30%乙醇至5 mL再加入0.3 mL 5% NaNO2溶液，搖勻放置6 min；加入0. 3 mL 10% A1Cl3溶液，搖勻并放置6 min后加入4 mL 1 mol/L NaOH溶液；加入0.4 mL水，搖勻放置15 min；于510 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，繪制吸光度（y）–濃度（x）的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.2.3金銀花黃酮樣液的測(cè)定方法。準(zhǔn)確吸取0.5 mL提取液并依據(jù)“1.2.2.2”測(cè)定方法進(jìn)行測(cè)定，同時(shí)以實(shí)際空白組做對(duì)照，于510 nm波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光度，具體計(jì)算參照樊琛等[9]的總黃酮含量計(jì)算。

2結(jié)果與分析

2.1HPLC方法學(xué)考察

2.1.1線性關(guān)系考察。由表2可知，各對(duì)照品在各自質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.2精密度試驗(yàn)。按照“1.2.1.5”操作，計(jì)算得出綠原酸、蘆丁、木犀草苷、異綠原酸A、異綠原酸C和木犀草素相對(duì)應(yīng)

的RSD值分別為0.33%、0.58%、0.24%、0.15%、128%、0.26%，表明該方法精密度良好。

2.1.3重復(fù)性試驗(yàn)。按照“1.2.1.6”操作，計(jì)算得出綠原酸、蘆丁、木犀草苷、異綠原酸A、異綠原酸C和木犀草素的RSD值分別為0.65%、0.261%、1.22%、0.47%、1.09%和203%，表明該測(cè)定方法的重復(fù)性良好。

2.1.4穩(wěn)定性試驗(yàn)。按照“1.2.1.7”操作，計(jì)算得出綠原酸、蘆丁、木犀草苷、異綠原酸A、異綠原酸C和木犀草素的峰面積的RSD分別為0.63%、2.91%、2.29%、0.70%、1.51%和2.83%，表明供試樣品溶液在32 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.5加樣回收率試驗(yàn)。按照“1.2.1.8”操作，結(jié)果發(fā)現(xiàn)（表3），綠原酸、蘆丁、木犀草苷、異綠原酸A、異綠原酸C和木犀草素的RSD分別為2.21%、2.53%、2.62%、2.76%、199%和2.45%。

2.2總黃酮的標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制以吸光度為縱坐標(biāo)、濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖1），得出回歸方程y=11.564x+0002 3（R2=0.999 6）。

2.3不同品系金銀花6種成分及總黃酮結(jié)果

對(duì)河南省農(nóng)科院藥用植物基地內(nèi)不同品系金銀花隨機(jī)選取5～10株，選擇開(kāi)花期一致的金銀花采樣，并將其在45 ℃烘干，打粉，過(guò)4號(hào)篩，依據(jù)HPLC方法及總黃酮檢測(cè)方法對(duì)不同品系金銀花6種成分及總黃酮進(jìn)行測(cè)量，結(jié)果見(jiàn)表4。

由表4可知，不同品系金銀花所含化學(xué)成分有所差異，但就藥典規(guī)定測(cè)定的綠原酸、木犀草苷而言，品系間差異無(wú)顯著性；蘆丁含量，YFY與其他品系間差異顯著；異綠原酸

A、異綠原酸C、木犀草素和總黃酮含量，品系間也存在一定的差異性。

2.4金銀花中6種成分、總黃酮間的相關(guān)性分析

金銀花在代謝過(guò)程中，往往會(huì)存在一定的相關(guān)性，這也為金銀花化學(xué)成分合成代謝及直觀分析金銀花提供可能性。由表5可知，金銀花各化學(xué)成分間有一定的相關(guān)性，綠原酸與木犀草苷、異綠原酸A與異綠原酸C、異綠原酸A和異綠原酸C與總黃酮均呈極顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.648、0.883、0690和0.636；蘆丁與總黃酮含量呈顯著負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為-0.476；異綠原酸A和異綠原酸C與木犀草素、木犀草素與總黃酮含量均呈現(xiàn)極顯著負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為-0.810、-0.688和-0.595。

2.5不同品系金銀花主成分分析計(jì)算相關(guān)系數(shù)的特征值和方差貢獻(xiàn)率，第1、2、3主成分的累計(jì)方差貢獻(xiàn)率為89565%，所以選取3個(gè)主成分進(jìn)行評(píng)價(jià)即可，它代表了不同品系金銀花所測(cè)指標(biāo)89.565%的信息量。

根據(jù)各成分含量（Z）和主成分計(jì)算公式可以得到線性組合如下：

成分1得分：F1=0.340 8×Z（綠原酸）+0.299 7×Z（蘆?。?0.207 3×Z（木犀草苷）-0.408 4×Z（異綠原酸A）-0.271 5×Z（異綠原酸C）+0.514 8×Z（木犀草素）-0.495 7×Z（總黃酮）

3討論

由HPLC與紫外分光光度法對(duì)同一產(chǎn)地5個(gè)品系金銀花結(jié)果可知，5個(gè)品系金銀花所含化學(xué)成分各有差異，綠原酸與木犀草苷間含量雖有差異，但差異不顯著，而其他4種成分及總黃酮含量，不同品系金銀花存在差異且差異顯著，說(shuō)明綠原酸與木犀草苷含量在這5個(gè)品系間具有一定的一致性，其他成分的差異表明品系間的差異。

各成分間相關(guān)性分析結(jié)果可知，不同成分間均呈現(xiàn)一定的相關(guān)，其中綠原酸與木犀草苷、異綠原酸A與異綠原酸C、異綠原酸A和異綠原酸C與總黃酮在這5個(gè)品系金銀花中呈現(xiàn)顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.648、0.833、0.690和0636；異綠原酸A和異綠原酸C與木犀草素、蘆丁和木犀草素與總黃酮在5個(gè)品系金銀花中均呈現(xiàn)顯著負(fù)相關(guān)，其相關(guān)系數(shù)分別為-0.081、-0.688、-0.476和-0.595。由以上結(jié)果可以表明，在評(píng)價(jià)這5種品系金銀花時(shí)，綠原酸可以在一定程度上代表木犀草苷，異綠原酸A在一定程度上反映出異綠原酸C、總黃酮與木犀草素的含量；另利用蘆丁與木犀草素指標(biāo)成分在一定程度上可以預(yù)測(cè)這5個(gè)品系金銀花總黃酮含量。5個(gè)品系金銀花內(nèi)在成分相關(guān)性分析結(jié)果亦說(shuō)明金銀花7個(gè)成分代謝存在一定的相互依存、相互促進(jìn)或抑制的關(guān)系。

由5個(gè)品系金銀花內(nèi)在成分對(duì)其進(jìn)行主成分分析，結(jié)果顯示，綜合評(píng)價(jià)中豫金2號(hào)金銀花評(píng)價(jià)最高，其次為豫封3號(hào)金銀花，評(píng)價(jià)中排序最低的為由山東引種的北花一號(hào)金銀花。由主成分結(jié)果可知，金銀花內(nèi)在質(zhì)量存在差異，這可能與其品種的特異性及地理氣候的影響有關(guān)，這為今后各地區(qū)引種金銀花適宜性評(píng)價(jià)提供了很好的試驗(yàn)證據(jù)。

該試驗(yàn)通過(guò)對(duì)5個(gè)品系金銀花進(jìn)行方差分析、相關(guān)性分析可知，5個(gè)品系金銀花所含成分均有所差異，且各成分間存在一定的相關(guān)性；通過(guò)主成分分析對(duì)5個(gè)品種金銀花綜合評(píng)價(jià)，說(shuō)明各品系金銀花之間存在一定差異。綜上所述，通過(guò)對(duì)5個(gè)品系金銀花藥材內(nèi)在成分及品系進(jìn)行評(píng)價(jià)，為金銀花藥材質(zhì)量的評(píng)價(jià)、指導(dǎo)金銀花規(guī)范化種植及新品系的選育提供理論依據(jù)。

參考文獻(xiàn)

[1]

國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典：一部[S].北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2015：221.

[2] 汪冶，肖聰穎，田蘭，等.金銀花本草考證的商榷[J].中國(guó)中藥雜志，2010，35（8）：1086-1088.

[3] 張衛(wèi)，黃璐琦，李超霞，等.金銀花品種的本草考證[J].中國(guó)中藥雜志，2014，39（12）：2239-2245.

[4] 張守平，辛寧，王柳萍.金銀花化學(xué)成分及質(zhì)量控制研究進(jìn)展[J].中國(guó)中醫(yī)藥信息雜志，2007，14（3）：84-86.

[5] 夏偉，余永亮，楊紅旗，等.金銀花化學(xué)成分及藥理作用研究進(jìn)展[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，45（33）：126-127，165.

[6] 王磊，劉金賢，趙金娟，等.我國(guó)金銀花種質(zhì)資源概述[J].中國(guó)現(xiàn)代中藥，2012，14（12）：28-30.

[7] 李淼，王永香，孟謹(jǐn)，等.HPLC法測(cè)定金銀花中新綠原酸等8種成分的量[J].中草藥，2014，45（7）：1006-1010.

[8] 王春秋，李雯霞.RP-HPLC法同時(shí)測(cè)定金銀花中10種化學(xué)成分[J].中成藥，2015，37（9）：1973-1977.

[9] 樊琛，曾慶華，王會(huì)，等.金銀花總黃酮的提取[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，42（10）：255-256.