豬流行性腹瀉病毒檢測技術研究進展

芮聰杰　潘孝成　沈學懷

摘要豬流行性腹瀉（PED）是由豬流行性腹瀉病毒（PEDV）引起的豬急性高度接觸性腸道傳染病，主要臨床癥狀表現(xiàn)為嘔吐、水樣腹瀉、脫水等。近年來，PED在全球范圍內暴發(fā)流行，使養(yǎng)豬業(yè)遭受巨大的經濟損失。對豬流行性腹瀉的檢測方法（病毒的分離和鑒定、免疫電鏡法、免疫學檢測法、分子生物學檢測等）進行了綜述，以期對豬流行性腹瀉病毒的防控提供理論依據。

關鍵詞豬流行性腹瀉病毒；檢測技術；研究進展

中圖分類號S852.65+1文獻標識碼

A文章編號0517-6611（2018）25-0022-04

Research Progress on the Detection Technique of Porcine Epidemic Diarrhea Virus

RUI Congjie1，2，PAN Xiaocheng1，SHEN Xuehuai1 et al

（1.Institute of Animal Husbandry and Veterinary Science，Anhui Academy of Agricultural Science，Hefei，Anhui 230031；2.College of Animal Science and Technology，Anhui Agricultural University，Hefei，Anhui 230061）

AbstractPorcine epidemic diarrhea （PED），caused by porcine epidemic diarrhea virus （PEDV），is a highly contagious，acute enteric viral disease of swine characterized by vomiting，watery diarrhea，dehydration and death.In recent years，swine epidemic diarrhoea has become a global epidemic.As a result，the pig industry has suffered huge economic losses.This paper reviewed the methods to detect PEDV，such as isolation and identification of PEDV，immunoelectron microscopy methods，immunological methods and methods in molecular biology，so as to provide theoretical basis for prevention and control of porcine epidemic diarrhea virus .

Key wordsPorcine epidemic diarrhea virus；Detection technique；Research progress

豬流行性腹瀉（porcine epidemic diarrhea，PED）是由豬流行性腹瀉病毒（porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）引起的豬急性高度接觸性腸道傳染病，主要表現(xiàn)為嘔吐、水樣腹瀉、脫水等特征[1-2]。各年齡豬只均可發(fā)病，但以10日齡以內哺乳仔豬的病死率最高。該病最早于1971年在英格蘭豬群中首次發(fā)現(xiàn)[3]。 1982年，比利時Pensaert等[4]分離出不同于傳染性胃腸炎的病毒，將其命名為類冠狀病毒CV777株； 隨后英國、德國、捷克、匈牙利等國家相繼報道有該病的發(fā)生。20世紀80年代，日本、韓國、泰國等亞洲國家也陸續(xù)有該病的報道。我國于1973年首次報道出現(xiàn)PEDV的感染，并于1982年分離該病毒獲得成功[5]。自2010 年底以來，我國大部分地區(qū)暴發(fā)了由PEDV變異毒株引起的腹瀉，此次疫情的臨床癥狀較為嚴重，初生仔豬的病死率可達90%[6]，給我國養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大的經濟損失。目前，該病在全球肆虐，美國、墨西哥、臺灣、日本、加拿大、多米尼加共和國、哥倫比亞、秘魯、韓國、烏克蘭等國家和地區(qū)也相繼暴發(fā)豬流行性腹瀉疫情[7-8]，給各國養(yǎng)豬業(yè)帶來嚴重損失，是近年來全球養(yǎng)豬業(yè)關注的疫病焦點。筆者對豬流行性腹瀉病毒的檢測方法（包括病毒的分離鑒定、免疫電鏡法、免疫學檢測、分子生物學檢測等）進行了綜述，以期對豬流行性腹瀉病毒的防控提供理論依據。

1病毒分離與鑒定

PEDV屬于冠狀病毒科冠狀病毒屬成員，核酸基因組為單股正鏈RNA囊膜病毒[7]。1982年，宣華等[5]以吉林分離毒株在胎豬腸組織原代單層細胞培養(yǎng)物中分離PEDV獲得成功。1988年，瑞典學者Hofmann等[8]成功在Vero細胞中培養(yǎng)PEDV，并發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)基中加入胰酶有利于PEDV在Vero細胞的增殖。孫瑩[9]從江蘇省某大規(guī)模豬場感染PEDV的哺乳仔豬小腸內容物樣品中分離到JSX2014毒株，接種Vero細胞產生的CPE病變明顯，但此病變特征與PEDV經典株CV777在細胞上產生的大空泡、細胞融合及多核細胞等病變特征不一致。此毒株的第55代已達到TCID50為10-4.71/mL，與2010年底以來國內PEDV分離株的親緣關系較近，與經典毒株CV777等的親緣關系較遠，為新型G2b型變異株。卓秀萍[10]利用Vero細胞分離出EM-P株，屬于G1-1亞型，與CV777株、韓國、日本、泰國等其他國家的流行毒株及2010年前的中國毒株處于同一亞群，經測定病毒的TCID50為10-5.5/mL。利用Vero細胞培養(yǎng)并加入一定濃度的胰酶分離PEDV毒株已成為使用最多的方法，添加胰酶的濃度從2.5 μg/mL到60 μg/mL不等。潘溪[11]用未添加胰酶的維持液成功分離出一株SH6變異毒株，證實在培養(yǎng)PEDV的Vero細胞中可以不添加胰酶。Shirato等[12]研究表明，沒有胰酶，PEDV可以在Vero細胞上增殖，但病毒釋放入培養(yǎng)液被強烈抑制。培養(yǎng)PEDV的細胞除了最常用的Vero細胞外，還有PK、CPK、MA104、PK-15、ESX等[13]，其中常用的是PK-15細胞。

2免疫電鏡法

免疫電子顯微鏡技術（immunoelectron microscopy，IEM）是免疫化學技術與電鏡技術結合的產物，是在超微結構水平研究和觀察抗原、抗體結合定位的一種方法。它主要分為兩大類：一類是免疫凝集電鏡技術，即采用抗原抗體凝集反應后，再經負染色直接在電鏡下觀察；另一類是免疫電鏡定位技術。免疫電鏡的應用使得抗原和抗體定位的研究進入到亞細胞的水平。由于PEDV屬于冠狀病毒，在形態(tài)和結構上與豬傳染性胃腸炎病毒（transmissible gastroenteritis virus of swine，TGEV）在普通電鏡下不容易區(qū)分。王繼科等[14]建立了改進的直接IEM 方法，以鑒定、區(qū)分PEDV和TGEV，該方法具有3次篩選作用。2015年，Lavazza等[15]建立了檢測PEDV等病毒的IAEM（immuno-aggregation electron microscopy）方法，該方法結合IEM法和ns-EM（negative staining electron microscopy method）法，是一種非常敏感和特異的方法。免疫電鏡法雖然具有敏感性高、特異性強、定性準確等優(yōu)點，但該方法對實驗儀器的要求較高。

3免疫學檢測方法

3.1血清中和試驗（serum neutralization test，SNT）

血清中和試驗通過檢測免疫血清與病毒中和后病毒的感染力，來判定免疫血清對病毒的中和力，該方法的特異性和靈敏性均較高，主要用于病毒毒株的種型鑒定（該方法不僅可以定屬，而且可以定型）、測定血清抗體效價、分析病毒的抗原性。謝明星等[16]于1988年采用固定病毒-稀釋血清法，建立了檢測血清中抗體消長規(guī)律的微量血清中和試驗，結果表明該方法既可用于PED早期診斷，也可用于流行病學調查，此外還也能用于免疫水平的檢測。石明明[17]在傳統(tǒng)中和試驗的基礎上進行了改進，建立了快速、新型的PEDV中和抗體檢測方法。試驗使用的rPEDV-GFP病毒是通過反向遺傳技術，將GFP熒光基因插入至PEDV基因序列中，由于GFP自帶熒光，只要PEDV-GFP在細胞中復制，就能看見熒光，用TBS-380微型熒光計對其反應結果進行分析并建立線性關系，比較血清樣品間抗體水平的高低，此方法與傳統(tǒng)中和試驗相比更省時間（12 h即可出結果）。

3.2免疫熒光法（immunofluorescence，IF）

免疫熒光法就是利用免疫熒光顯微鏡觀察抗原與抗體特異性的結合，包括直接免疫熒光法、間接免疫熒光法。崔現(xiàn)蘭等[18]建立了檢測PEDV的直接免疫熒光法和間接免疫熒光法，其對豬流行性腹瀉病毒（PEDV）人工感染仔豬的陽性檢出率為91.3%（42/46）。林志雄等[19]用適應于Vero、Pk15等傳代細胞株生長繁殖的PEDV-G1株建立直接免疫熒光法，同時與哈爾濱獸醫(yī)研究所的熒光抗體方法比較，陽性符合率達95%（19/20），陰性符合率達90%（9/10），并不與豬傳染性胃腸炎病毒、豬細小病毒、輪狀病毒和大腸桿菌等發(fā)生交叉反應，表明該方法具有較高的準確性和特異性。朱維正等[20]用間接血凝法（IHA）和間接免疫熒光法（IFAT）對感染PEDV豬的血清進行檢測，并對這2種方法進行比較，結果發(fā)現(xiàn)IHA的陽性檢出率（50.43%）低于IFAT（89.25%）。免疫熒光法是比較經典的檢測PEDV的方法。

3.3酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA）

由于ELISA檢測方法具有靈敏度高、特異性強、反應快速、操作相對簡單、可對血清進行批量檢測、既可以檢測免疫后血清抗體也可以檢測感染抗原等優(yōu)點，該方法是檢測PEDV應用最廣泛的方法之一。潘溪[11]通過將PEDV的N基因克隆到pCoid-1DNA載體中進行原核表達，構建了pCoid-1-N的重組質粒，并將純化的N蛋白進行包被，作為包被抗原構建間接ELISA方法，對50份已知來源和背景的血清進行了檢測，符合率達94%。同時，還制備了N蛋白的單克隆抗體作為競爭性抗體，建立了競爭ELISA檢測方法。鄭芳園[21]將PEDV的S蛋白用pET-28a為載體進行原核表達，并將純化的Sc蛋白作為包被抗原，建立了檢測PEDV抗體的間接ELISA方法。將5份陽性血清進行1∶3 200倍稀釋后檢測結果呈陽性，證實了此方法的敏感性和重復性；利用該方法對偽狂犬病毒（PRV）、豬圓環(huán)病毒2型病毒（PCV2）、口蹄疫病毒（FMDV）、豬藍耳病毒（PRRSV）的陽性血清進行檢測，結果均呈陰性，證實了此方法的特異性。張清真等[22]以體外表達的S蛋白為包被抗原，商品化單抗為捕獲抗體，對IgG進行生物素標記作為二抗，建立了檢測PEDV的雙夾心ELISA方法，該方法的最低檢測限量為20 ng/μL ， 且穩(wěn)定性和特異性較好。對25份臨床豬腹瀉樣品進行PEDV

檢測，3份檢出為陽性，與RT-PCR結果的符合率為100%。王晨燕等[23]采用鼠源抗PEDV單克隆抗體為捕獲抗體，以兔源多克隆抗體為檢測抗體，建立了PEDV雙抗體夾心ELISA方法，該方法與輪狀病毒、豬傳染性胃腸炎病毒無交叉反應，敏感度達30 μg/mL，與PCR檢測符合率為92.30%。

3.4膠體金免疫層析技術

膠體金顆?？梢酝ㄟ^靜電及其表面的物理特性與抗體、葡萄球菌蛋白A （SPA）等多種生物分子結合，形成蛋白質膠體金復合物，即膠體金標記物[24]。膠體金免疫層析技術因其具有操作簡單、不需要昂貴的精密儀器、對檢測人員的素質要求不高、有利于在基層推廣等優(yōu)點，目前已在許多領域得到了廣泛應用，如肉食品藥物殘留檢測[25]、糧食霉菌毒素的檢測、抗原抗體檢測、獸醫(yī)疾病診斷等。魏艷秋[26]應用雜交瘤技術，以制備的N蛋白特異性單克隆抗體為材料，建立了檢測PEDV的膠體金免疫層析方法，并用RT-PCR的方法對13份不同地區(qū)采集的豬小腸樣品進行檢測，發(fā)現(xiàn)這2種方法的陽性檢出率分別為38.46%（5/13）和 46.15%（6/13），陽性樣品的總符合率為83.5%。張利勃等[27]將基因工程表達的PEDV M蛋白抗原作為檢測線，自制的抗葡萄球菌蛋白A（SPA）多抗血清包被硝酸纖維素膜作為質控線，對葡萄球菌蛋白A（SPA）進行膠體金標記作為指示介質，制成了檢測PEDV感染豬血清抗體的快速檢測試紙，并與ELISA檢測方法進行比較，二者有相似的靈敏度，75份樣品中有65份陽性、7份陰性，符合率達96%。

安徽農業(yè)科學2018年

4分子生物學檢測方法

4.1核酸探針技術

核酸探針技術是20世紀70年代在基因工程學的基礎上發(fā)展起來的[28]，在生化分析、分子藥理學、動物疾病檢測及進出口貿易檢測等領域得到廣泛應用。隨著科學技術的進步，新的核酸探針技術也得到了快速發(fā)展，目前探針的種類有DNA探針、RNA探針、寡核苷酸探針和新型光學核酸探針[29]。Kim等[30]將已知序列的核苷酸用地高辛進行標記，在特定條件下與人工感染仔豬PEDV的N蛋白的基因進行堿基配對，結果發(fā)現(xiàn)PEDV檢出率為9333%（14/15）。Jung等[31]利用基于RT-PCR建立的斑點雜交技術，采用地高辛標記過的cDNA探針同時對PEDV和TGEV感染后的豬糞便樣品進行檢測，檢測結果與RT-PCR檢測結果相一致，且敏感性更高。

4.2聚合酶鏈式反應

聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）是1985年由美國PE-Cetus公司的Mullis發(fā)明的一種可在體外擴增特定基因或RNA序列的技術。PCR技術操作簡單，結果可靠，目前已被廣泛應用于醫(yī)學、農學、考古等領域進行基因研究和分析。隨著對PCR技術研究的加深，在傳統(tǒng)PCR的基礎上又衍生出多種PCR技術。這些技術包括實時熒光定量PCR、多重PCR、套式PCR、納米PCR，PCR技術已經成為研究PEDV的基本技術手段并得到廣泛應用。李劼[32]利用RT-PCR方法擴增從仔豬臨床病料中分離出的一株PEDV（CHM2013），對其進行全基因組序列測定，并通過繪制進化樹，CHM2013屬于PEDV的G1亞群，與經典毒株CV777、SM98、DR13屬于同一亞群，全基因組同源性為97.9%～99.9%，同時基于PEDV毒株CHM2013和分離出的強毒株BJ-2011-C的全程基因組設計引物，進行分段擴增，為進一步研究S基因突變對弱毒株在體外增殖和致病性的研究提供了技術支持。石堅等[33]根據GenBank中當前流行毒株S基因序列設計了2條特異擴增引物，建立了一套能夠區(qū)分PEDV變異毒株和經典毒株的套式RT-PCR方法。此方法不僅能檢測出PEDV，而且能快速鑒定毒株是否發(fā)生了變異，并且不會受其他非特異性產物的影響，靈敏度也較高。施開創(chuàng)等[34]建立了能夠區(qū)分PEDV經典株、變異株及疫苗株的多重PCR方法，并與豬的其他病毒[如傳染性胃腸炎病毒（TGEV）、輪狀病毒（RV）、豬瘟病毒（HCV）、偽狂犬病毒（PRV）]無交叉反應。劉琪等[35]建立了一種能夠快速區(qū)分PEDV疫苗毒株與野毒株的巢式PCR方法，該方法能夠對PEDV與TGEV、RV、HCV、PRV等進行鑒別。沈思思等[36]采用靶向PEDV S基因的引物和探針，建立了檢測PEDV的恒溫隔絕式PCR（iiPCR），結果表明該方法的特異性和靈敏性與實時熒光定量PCR方法相當，使用的恒溫隔絕式PCR檢測儀比傳統(tǒng)的PCR儀反應效率高，其反應總過程只需42 min，此外一鍵操作，無需設置反應條件，操作簡單，結果易判讀，對操作人員素質要求不高，無需電泳，減少了交叉污染和人為因素的影響。邢娜[37]通過系統(tǒng)化篩選TGEV和PEDV特異性探針并進行優(yōu)化，分別標記于磁性顆粒和納米金顆粒上，形成MMPs-RNA-AuNPs“三明治”復合物，將病毒核酸信號進一步擴大，并利用特殊引物通過PCR檢測特異性，分別建立了特異性針對TGEV和PEDV基于納米顆粒的超敏檢測方法（ultrasensitive nanoparticle DNA probebased PCR assay，UNDP-PCR），并在此基礎上又建立了同時檢測TGEV和PEDV的雙重UNDP-PCR檢測技術。

4.2.1實時熒光定量PCR。

實時熒光定量PCR（real-time PCR，RT-PCR）是在標準PCR的基礎上發(fā)展起來的檢測技術，該技術是采用熒光探針或SYBR Green Ⅰ 熒光染料通過連續(xù)監(jiān)測熒光信號強弱的變化來判斷特異性產物的量。李亞青[38]根據GenBank中PEDV的CV777株及Attenuated DR13株ORF3基因序列設計了一對特異性引物，并以野毒株和疫苗毒的cDNA為模板，優(yōu)化了引物濃度和退火溫度，構建了Eva Green熒光定量RT-PCR方法，并經過多次驗證，特異性和重復性好。此外，還可以對感染PEDV病豬的心、肝、脾、肺、腎、淋巴結和腸組織中的PEDV含量進行了定量分析。勞秀杰等[39]根據PEDV N基因設計了一對引物，利用SYBR Green I熒光染料建立了SYBR Green實時熒光定量RT-PCR檢測方法，對同一樣品3次重復試驗，變異系數(shù)小于0.9%，最低檢測限為1×100copy/μL，比常規(guī)PCR敏感度高100倍（1×102copy/μL），特異性強，標準曲線線性關系好，相關系數(shù)為1.0，擴增效率為105.4%。劉鄧等[40]建立了多重實時熒光定量RT-PCR方法，并對PEDV、TGEV和RV進行鑒別檢測，結果發(fā)現(xiàn)該方法具有較高的敏感性、特異性和重復性。

4.2.2納米PCR。

納米PCR是納米技術與生命科學交叉的成果。2005年中國科學院應用物理所與上海交通大學首次報道了納米金粒子（Au nanoparticles）對 PCR 反應的優(yōu)化作用[41]。沈鶴柏等[42]將引物連接到金納米顆粒表面，研究基于納米金顆粒的PCR，將均相體系中的 PCR 技術擴展到納米粒子表面。目前，納米PCR已經在生命科學、動物醫(yī)學等領域得到廣泛應用。朱禹[43]根據PEDV和TGEV N基因的核苷酸序列分別設計了2對引物并擴增N基因，以pMD18-T為載體，與N基因連接作為標準質粒，設計出特異性引物，以特異性引物為模板，優(yōu)化退火溫度和引物的量，建立納米PCR方法。靈敏性試驗表明，質粒PEDV-N、TGEV-N的最低檢出量分別為7.6×101和8.5×101copy/μL。敏感性試驗表明，普通PCR檢測的病毒RNA最低量為2.4×10-3和1.7×10-2 μg/mL，納米PCR結果比普通PCR敏感 10倍。通過理論計算可得到納米PCR檢測PEDV及TGEV的最低量達到100.5 TCID50/mL，以其他多種病毒 PPV、PCV-2、PRRSV、PRV、CSFV和 H1N1作為檢測對象，進行特異性試驗，結果均未擴增出任何條帶。利用納米PCR的敏感性和特異性，用于臨床診斷和流行病學調查，為PEDV的早期診斷提供了新的方法。

4.3環(huán)介導等溫擴增技術

環(huán)介導等溫擴增技術最早由Notmi等[44]于2000年創(chuàng)建，是一種體外擴增特異性基因片段的分子生物學技術，該技術被廣泛應用于核酸檢測的各個領域，如病原體的識別、生物標志物檢測、性別鑒定等。在常規(guī)LAMP擴增的基礎上，各國學者對其進行了改進并開發(fā)出一系列多重LAMP擴增技術，如微型擴增技術以及實時熒光環(huán)介導技術。羅亞坤等[45]針對PEDV N基因設計了6條引物并對LAMP反應體系和反應溫度進行了優(yōu)化，建立了檢測PEDV的環(huán)介導等溫擴增法，結果發(fā)現(xiàn)其檢測限量為91 copy/mL，是常規(guī)PCR檢測方法敏感性的100倍，并與RT-PCR方法檢測的75份臨床樣品進行對比，發(fā)現(xiàn)這2種方法的檢測符合率為97.3%。田野等[46]也建立了檢測PEDV的逆轉錄環(huán)介導等溫核酸擴增（RT-LAMP），是在原反應液中加入一定量的逆轉錄酶，實現(xiàn)了RNA的一步擴增。時建立等[47]針對PEDV S基因設計特異性引物，建立了快速檢測PEDV的LAMP方法。此方法特異性好，敏感性強，將反轉錄后的病毒cDNA稀釋到108倍仍可檢出。

5小結

豬流行性腹瀉的早期診斷和豬群抗體水平的檢測，在生產上對疾病的預防與控制起著關鍵性作用，因此選擇一種可靠的、敏感性和特異性高、易于操作和檢測成本相對低的檢測方法也十分重要。隨著科學技術的發(fā)展，PEDV的檢測方法也有了顯著進步，涉及免疫學、分子生物學等領域。目前，酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA）和聚合酶鏈式反應（PCR）這2種方法在臨床上的應用較為普遍，尤其是PCR方法（多重PCR、套式PCR、熒光定量PCR）與ELISA方法相比靈敏性和特異性更高，但對儀器設備要求高，對操作人員素質也有一定要求，特別是熒光定量PCR在設備和人員上要求更加嚴格，這使得該方法在基層生產中的推廣有一定的限制。使用任何一種方法都很難對疾病做出確切診斷，可根據現(xiàn)有情況選擇可靠性、準確性高的2種或2種以上的方法進行聯(lián)合診斷。隨著科學技術的不斷進步，相信未來會出現(xiàn)一種檢測迅速、操作簡單、成本相對較低、可靠性和準確性高的新檢測技術，從而為豬流行性腹瀉的診斷、流行病學調查和防控奠定基礎。

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