懸鉤子屬野生種和栽培種資源SSR引物篩選與評(píng)價(jià)

耿佳麒，王宇航，雷蕾，孫海悅，周強(qiáng)，唐雪東，梁英海

摘要 [目的]分析懸鉤子屬植物的遺傳多樣性，研究現(xiàn)存懸鉤子SSR引物的通用性。[方法]通過簡(jiǎn)單重復(fù)序列標(biāo)記（SSR）用12份懸鉤子屬野生和栽培種類資源對(duì)40對(duì)引物進(jìn)行篩選。[結(jié)果]共篩選出8對(duì)引物對(duì)全部12個(gè)樣品擴(kuò)增良好，多態(tài)性比率為100%，可用于遺傳多樣性的分析。[結(jié)論]該試驗(yàn)篩選的8對(duì)引物可為下一步研究提供依據(jù)。

關(guān)鍵詞 懸鉤子；SSR引物；篩選；評(píng)價(jià)

中圖分類號(hào) S663.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2018）06-0083-04

Screening and Evaluation of SSR Primers in Wild and Cultivated Species of Rubus L.

GENG Jiaqi，WANG Yuhang，LEI Lei et al （Jilin Agricultural University， Changchun， Jilin 130118）

Abstract [Objective]To analyze the genetic diversity of Rubus L. and study the universality of the existing SSR primers of Rubus L.. [Method]Forty pairs of primers were screened from 12 wild and cultivated species of Rubus L.by simple repeated sequence marker （SSR）. [Result]8 pairs of primers were screened and amplified all 12 samples with a polymorphism ratio of 100%， which could be used for genetic diversity analysis. [Conclusion]The 8 pairs of primers in this experiment can provide the basis for further study.

Key words Rubus L.；SSR primers；Screening；Evaluation

懸鉤子（Rubus L.）是多年生落葉灌木植物[1]，種類豐富，雜合度高，在寒帶及溫帶地區(qū)均有分布。在我國(guó)，懸鉤子屬植物有150個(gè)種以上[2]。懸鉤子屬栽培品種具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和藥用價(jià)值，其果實(shí)可用于鮮食、加工和醫(yī)用[3-4]。

隨著果樹分子生物技術(shù)快速發(fā)展，國(guó)內(nèi)外學(xué)者在形態(tài)學(xué)、孢粉學(xué)、細(xì)胞學(xué)以及同工酶鑒定研究基礎(chǔ)上，加大了對(duì)懸鉤子屬植物資源分子水平的研究[4]，應(yīng)用分子標(biāo)記分析了懸鉤子屬植物的遺傳多樣性[5]。目前，已有利用SSR和RAPD分子標(biāo)記分析懸鉤子栽培種資源遺傳多樣性的報(bào)道[6]，但對(duì)懸鉤子野生種資源的研究較少。

懸鉤子屬樹莓屬于第三代新興小漿果[7]。在農(nóng)業(yè)供給側(cè)結(jié)構(gòu)性改革和生態(tài)建設(shè)背景下，有必要對(duì)我國(guó)蘊(yùn)藏的大量懸鉤子野生資源進(jìn)行有效收集評(píng)價(jià)和開發(fā)利用，其遺傳多樣性研究是重要的基礎(chǔ)工作。由于懸鉤子屬植物類型多樣，雜合度高，可應(yīng)用SSR分子標(biāo)記開展相關(guān)研究。目前，懸鉤子屬植物SSR引物主要為蘇格蘭詹姆斯·赫頓研究所（http：//www.hutton.ac.uk/）以及Graham等[8]所開發(fā)引物，這些引物是否適用于我國(guó)野生懸鉤子資源鮮見報(bào)道。該研究旨在篩選評(píng)價(jià)Graham等所開發(fā)引物，以供國(guó)內(nèi)相關(guān)研究參考，并考察相同SSR引物在不同地緣分布資源間的通用性問題，以提出懸鉤子屬植物分子水平資源研究建議。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料。植物材料有茅莓懸鉤子、庫(kù)頁(yè)懸鉤子、牛迭肚、綠葉懸鉤子、黃樹莓、黑樹莓、歐洲莓、奧瑞斯8份資源，以及于2016年于蛟河采集的野生資源牛迭肚（J-1-3）、牛迭肚（J-1-4）、牛迭肚（J-2-1）、牛迭肚（J-2-2）4份，共12份材料（表1）。取上述材料嫩葉，供提取基因組DNA。

1.1.2 藥品。CTAB、Tris堿、氯化鈉、氫氧化鈉、β-巰基乙醇、無(wú)水乙醇、三氯甲烷、異戊醇、瓊脂糖、甲叉丙烯酰胺、過硫酸銨、TEMED、rTaq預(yù)混酶、超純水。試驗(yàn)藥品購(gòu)于TaKaRa公司。

1.1.3 引物。SSR引物為Graham等[8]開發(fā)的30對(duì)引物和詹姆斯·赫頓研究所開發(fā)的10對(duì)引物，SSR引物由金唯智公司合成。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取與檢測(cè)。供試材料在液氮中研磨至粉末狀，加入離心管中，采用CTAB法[9]提取12份樣品的DNA，并用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其DNA質(zhì)量，用超微量分光光度計(jì)檢測(cè)DNA濃度與純度，將條帶清晰、質(zhì)量良好的DNA稀釋至20 ng/μL，-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 SSR-PCR擴(kuò)增。PCR所采用的體系是經(jīng)過優(yōu)化的最適體系，退火溫度為55 ℃。采用20 μL反應(yīng)體系：ddH2O 11.2 μL，上游引物0.8 μL，下游引物0.8 μL，模板DNA（DNA濃度為20 ng/μL）3 μL，TaqDNA聚合酶（5 U/L）0.2 μL，dNTP（10 mmol/L）1.2 μL，10×Buffer（含Mg2+）2 μL。95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min；4 ℃保存。

1.2.3 PCR產(chǎn)物檢測(cè)。

1.2.3.1 瓊脂糖凝膠電泳。PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其擴(kuò)增結(jié)果，將擴(kuò)增出的條帶清晰且多態(tài)性好的引物進(jìn)行下一步聚丙烯酰氨凝膠電泳檢測(cè)。

1.2.3.2 6%聚丙烯酰胺凝膠電泳。①清洗，用洗滌劑清洗玻璃板后蒸餾水沖洗干凈，用無(wú)水乙醇清潔后晾干備用；②注膠，安裝好玻璃板后，將1%瓊脂糖凝膠注入玻璃板底部，密封玻璃板，注意不要有氣泡；待膠凝固后，將配制好的聚丙烯酰胺凝膠定點(diǎn)緩慢注入玻璃板空隙（注入過程應(yīng)盡量避免氣泡的產(chǎn)生），插入齒梳，避免齒梳周圍產(chǎn)生氣泡，靜置50～60 min待凝膠凝固；③預(yù)電泳，凝膠凝固后，小心拔出齒梳，用電泳液沖洗膠孔；玻璃板內(nèi)槽加滿1×TBE緩沖液，外槽緩沖液加至1/3體積即可，設(shè)置電壓350 V，電流500 mA，預(yù)電泳60 min；④上樣，按照樣品∶上樣緩沖液=10∶3比例混合，待預(yù)電泳結(jié)束后進(jìn)行上樣，電壓240 V，電流500 mA，電泳90 min。

1.2.3.3 銀染。電泳結(jié)束后，取下凹型玻璃板，將凝膠留在平板玻璃上。①清洗，清水沖洗膠面30 s，蒸餾水沖洗膠面30 s；②固定，固定液沒過膠面，搖10～20 min；③洗膠，蒸餾水沖洗膠面2 min，沖洗2次，傾斜玻璃板瀝水；④染色，硝酸銀染色液沒過膠面，搖6 min；⑤洗膠，蒸餾水沖洗凝膠10 s左右，沖洗2次，取出膠板，瀝干；⑥顯色，將膠板浸于提前預(yù)冷的500 mL顯色液中，搖床搖至所有條帶出現(xiàn)，即停止顯色；⑦洗膠，蒸餾水沖洗膠板2 min；⑧固定，膠板完全浸于固定液，固定10 min，清洗干凈后，瀝干水再進(jìn)行拍照和后續(xù)數(shù)據(jù)分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析 根據(jù)聚丙烯酰氨凝膠電泳條帶片段大小和SSR特異性條帶特點(diǎn)，使用GEL-PRO軟件，將同一引物相同片段大小SSR特異條帶計(jì)為1，無(wú)條帶記為0，擴(kuò)增不良或非特異性條帶不計(jì)入其中，形成0-1矩陣，并用Popgene 32軟件，分析多態(tài)性位點(diǎn)百分比（PPB）、有效等位基因數(shù)（Ne）、Neis指數(shù)（h）、Shannon指數(shù)（I）。

2 結(jié)果與分析

2.1 SSR引物篩選結(jié)果 利用40對(duì)（表2）SSR引物對(duì)12份供試材料進(jìn)行SSR-PCR擴(kuò)增，經(jīng)電泳檢測(cè)，共有8對(duì)SSR引物在12份資源中擴(kuò)增出差異性強(qiáng)和多態(tài)性良好的產(chǎn)物（表2、圖1、圖2），分別為Rubus25a、Rubus110a、Rubus117a、Rubus119a、Rubus166b、Rubus167a、Rubus233a、Neb1G02，占總引物數(shù)的20%，多態(tài)性百分率為100%，這些引物可以在野生種和栽培種中擴(kuò)增出條帶。Rubus123a、Rubus194h、Neb1A10、Neb1J15、Neb1k24引物，僅在茅莓懸鉤子、庫(kù)頁(yè)懸鉤子、綠葉懸鉤子中成功擴(kuò)增出條帶，但是對(duì)于牛迭肚懸鉤子擴(kuò)增效果較差（圖3、4）。

2.2 引物多態(tài)性分析 所篩選出的8對(duì)引物共擴(kuò)增出142條帶，平均每個(gè)引物擴(kuò)增出17.75條帶。根據(jù)目的條帶大小統(tǒng)計(jì)，每個(gè)引物最多擴(kuò)增出2個(gè)位點(diǎn)，引物Rubus110a檢測(cè)出的條帶最多為18條，Rubus25a檢測(cè)出的條帶最少為12條。全部引物的目的片段均為100～250 bp，所統(tǒng)計(jì)的條帶數(shù)目均在目的條帶上下，片段大小差異不大。

2.3 SSR位點(diǎn)分析 應(yīng)用Popgene32軟件分析8對(duì)SSR引物擴(kuò)增獲得的0-1矩陣數(shù)據(jù)，表明每個(gè)位點(diǎn)的有效等位基因數(shù)（Ne）在1.600 0～1.976 7，平均等位基因數(shù)為1.766 6。Neis基因多樣性指數(shù)（h）分布在0.267 2～0.494 0，平均每個(gè)位點(diǎn)的Neis指數(shù)為0.399 8。所得到的Shannon指數(shù)（I）為0.417 0～0.687 1，平均值為0.579 1（表3）。

3 討論與結(jié)論

3.1 懸鉤子屬植物資源有待評(píng)價(jià)開發(fā)利用 我國(guó)大小興安嶺、長(zhǎng)白山等地區(qū)蘊(yùn)藏豐富的懸鉤子屬資源，但由于全球氣候變化和人為活動(dòng)頻繁，樹莓資源正在嚴(yán)重流失，需要有針對(duì)性開展資源收集評(píng)價(jià)與開發(fā)利用工作，而利用分子標(biāo)記技術(shù)開展分子水平資源研究具有重要意義。Graham 所開發(fā)的SSR引物在國(guó)內(nèi)外相關(guān)研究中應(yīng)用廣泛，用于遺傳多樣性[10]、親緣關(guān)系[11]、遺傳圖譜構(gòu)建[8，12]，但國(guó)外多數(shù)研究集中于栽培品種（品系），甚至只給出引物出處，未明確指明引物名稱或序列，給相關(guān)研究帶來(lái)被動(dòng)局面；國(guó)內(nèi)學(xué)者也應(yīng)用這些引物開展相關(guān)分子標(biāo)記研究[13]，亦主要研究樹莓栽培資源。該研究針對(duì)上述情況，評(píng)價(jià)篩選出8對(duì)SSR引物用于茅莓懸鉤子、庫(kù)頁(yè)懸鉤子、綠葉懸鉤子、牛迭肚等資源SSR-PCR擴(kuò)增，可為相關(guān)資源分子水平評(píng)價(jià)提供重要數(shù)據(jù)參考。

3.2 懸鉤子屬植物SSR引物通用性及開發(fā)利用 該研究考察了Graham等利用國(guó)外資源開發(fā)的引物在我國(guó)野生和栽培種中的通用性問題，在選用的40對(duì)SSR引物中僅篩選出8對(duì)引物用于全部供試材料，表明了不同地理分布栽培資源間，尤其栽培與野生資源間存在引物通用性，也表明了懸鉤子屬植物SSR序列進(jìn)化保守性。

目前，SSR分子標(biāo)記技術(shù)已廣泛用于果樹遺傳多樣性、親緣關(guān)系和遺傳圖譜構(gòu)建研究[14-17]，應(yīng)用價(jià)值較高。由于該研究?jī)H在7個(gè)栽培和野生種共計(jì)12份資源上評(píng)價(jià)了供試引物，且僅獲得8對(duì)可在全部材料成功擴(kuò)增的引物，在引物數(shù)量和資源針對(duì)性上，不能滿足未來(lái)對(duì)豐富懸鉤子屬資源收集保存評(píng)價(jià)利用工作的需要。在組學(xué)和大數(shù)據(jù)時(shí)代[2，18-20]，可利用新方法新技術(shù)，針對(duì)我國(guó)懸鉤子屬植物資源，開發(fā)利用分子標(biāo)記，尤其是功能分子標(biāo)記[20]，支撐和促進(jìn)樹莓等小漿果產(chǎn)業(yè)發(fā)展。

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