HPLC法同時測定云南小?？Х戎?種成分的含量

邱碧麗 代麗玲 劉超 張紹龍 楊艷

摘要 [目的]建立云南小粒咖啡中綠原酸、葫蘆巴堿、咖啡酸、D-（-）-奎寧酸含量的測定方法。[方法]采用Venusil ASB C18為色譜柱，甲醇-0.1%磷酸水為流動相，等度洗脫，流速0.9 mL/min，柱溫35 ℃，檢測波長：綠原酸和咖啡酸330 nm，葫蘆巴堿和D-（-）-奎寧酸210 nm。[結(jié)果]綠原酸、葫蘆巴堿、D-（-）-奎寧酸、咖啡酸分別在14.6～146.0 μg/mL（r=1.000 0）、10.2～102.0 μg/mL（r=1.000 0）、11.6～116.0 μg/mL（r=0.999 8）、0.499 5～4.995 0 μg/mL（r=0.999 8）的濃度范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好，加標(biāo)回收率為93.28%～97.46%。[結(jié)論]該方法簡便、準(zhǔn)確、重復(fù)性好，可用于云南小?？Х戎芯G原酸、葫蘆巴堿、咖啡酸和D-（-）-奎寧酸含量的測定。

關(guān)鍵詞 云南小粒咖啡;綠原酸;葫蘆巴堿;咖啡酸;D-（-）-奎寧酸;HPLC

中圖分類號 TS273文獻標(biāo)識碼 A文章編號 0517-6611（2018）34-0173-03

小粒咖啡亦稱為阿拉比卡種（Arabica），茜草科（Rubiaceae）咖啡屬大灌木或小喬的種子，是最傳統(tǒng)的阿拉伯咖啡品種[1-2]。云南種植的咖啡主要為小粒種咖啡，占全國咖啡豆產(chǎn)量的98.80%[3]。咖啡中的綠原酸具有清除自由基、抗氧化[4]、抗癌[5-6]、抗菌及抗病毒[7-8]等功效;葫蘆巴堿具有降血糖、抗腫瘤等作用[9-10];咖啡酸也具有抗菌、抗病毒、中樞興奮等生物活性[11]。有關(guān)咖啡中綠原酸、葫蘆巴堿、D-（-）-奎寧酸、咖啡酸含量的測定方法研究鮮見報道。筆者建立了HPLC法同時測定云南小粒咖啡中綠原酸、葫蘆巴堿、咖啡酸和D-（-）-奎寧酸含量的方法，以期為云南小?？Х荣|(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究、咖啡豆的綜合利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品?？Х壬狗謩e采自保山市、普洱市、臨滄市3個市的咖啡種植基地，品種均為卡蒂姆。焙炒咖啡豆：取搜集到的咖啡生豆的50%，進行烘焙;烘焙條件：中焙，烘焙時間10 min，溫度200 ℃，色度值58。

1.1.2 儀器。U3000高效液相色譜儀（配置DAD檢測器，美國戴安公司）;MS205DU電子分析天平（瑞士METTLERROLEDD公司）;EXceed-AC-24超純水機（成都康寧實驗專用純水設(shè)備）;GT SONIC-P3超聲波清洗儀（固特超聲股份有限公司）。

1.1.3 試劑。甲醇（色譜級，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所）;磷酸（美國TEDIA）。標(biāo)準(zhǔn)品：綠原酸（德國 Dr.Ehrenstorfer GmbH）;葫蘆巴堿、咖啡酸、D-（-）-奎寧酸，均購自壇墨質(zhì)檢。

1.2 方法

1.2.1 對照品溶液的制備。取葫蘆巴堿、綠原酸、D-（-）-奎寧酸、咖啡酸適量，精密稱定，置25 mL容量瓶中，加0.1%的磷酸溶解并定容至刻度，搖勻，即得混合對照品溶液（每1 mL含葫蘆巴堿102 μg、綠原酸146 μg、咖啡酸4.995 μg、D-（-）-奎寧酸116 μg）。

1.2.2 供試品溶液的制備?？Х榷寡心コ煞勰ㄟ^0.45 mm篩），準(zhǔn)確稱取咖啡生豆粉末0.5 g（焙炒咖啡粉1.0 g），置于50 mL容量瓶中，加入50%的甲醇約25 mL，超聲提取20 min，將上清液濾入50 mL容量瓶中，濾渣再加入20 mL 50%甲醇，超聲提取15 min，合并2次提取液，用50%甲醇定容至50 mL，搖勻，過0.45 μm濾膜，待測。

1.2.3 色譜條件。Venusil ASB C18柱（粒徑5 μm，柱長250 mm×4.5 mm）;流動相為甲醇+0.1%磷酸=22+78，流速 0.9 mL/min，等度洗脫;檢測波長：綠原酸和咖啡酸330 nm，葫蘆巴堿和D-（-）-奎寧酸210 nm;柱溫35 ℃;進樣量10 μL。

1.2.4 方法學(xué)考察。

1.2.4.1 線性關(guān)系的考察。精密吸取“1.2.1”項下的混合對照品溶液2、4、6、8、10 μL，注入色譜儀，以進樣量濃度為自變量（X）、色譜峰面積為因變量（Y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，建立回歸方程。

1.2.4.2 精密度試驗。精密吸取混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液10 μL，按“1.2.3”色譜條件，連續(xù)進樣6針，以綠原酸、葫蘆巴堿、D-（-）-奎寧酸、咖啡酸的峰面積作為考察指標(biāo)，計算RSD值。

1.2.4.3 重復(fù)性試驗。分別稱取同一咖啡生豆供試品6份、焙炒咖啡豆供試品6份，按“1.2.2”方法制成供試品溶液，按“1.2.3”色譜條件進樣，計算6份供試品中綠原酸、葫蘆巴堿、D-（-）-奎寧酸、咖啡酸的含量及RSD值。

1.2.4.4 穩(wěn)定性試驗。分別稱取同一咖啡生豆供試品溶液1份、焙炒咖啡豆供試品溶液1份，按“1.2.3”色譜條件，分別于0、2、4、8、12、16、24 h進樣，以綠原酸、葫蘆巴堿、咖啡酸、D-（-）-奎寧酸的峰面積作為考察指標(biāo)，計算RSD值。

1.2.4.5 加樣回收試驗。稱取同一咖啡生豆和焙炒豆樣品各3份，咖啡生豆粉每份約0.25 g，焙炒咖啡粉每份約0.5 g，分別加入適量的綠原酸、葫蘆巴堿、D-（-）-奎寧酸、咖啡酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按“1.2.2”方法制成供試品溶液，測定供試品中綠原酸、葫蘆巴堿、D-（-）-奎寧酸、咖啡酸的含量，并計算回收率及RSD值。

1.2.4.6 含量測定。取不同產(chǎn)地的咖啡生豆和焙炒豆，按“1.2.2”方法制成供試品溶液，按照“1.2.3”色譜條件測定咖啡中綠原酸、葫蘆巴堿、D-（-）-奎寧酸、咖啡酸的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法學(xué)考察

2.1.1 線性關(guān)系的考察。以對照品溶液濃度為橫坐標(biāo)（X）、峰面積為縱坐標(biāo)（Y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出回歸方程。結(jié)果顯示（表1），綠原酸、葫蘆巴堿、D-（-）-奎寧酸和咖啡酸分別在14.6～146.0 μg/mL（r=1.000 0）、10.2～102.0 μg/mL（r=1.000 0）、11.6～116.0 μg/mL（r=0.999 8）、0.499 5～4.995 0 μg/mL（r=0.999 8）的濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.2 精密度試驗。通過對混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液重復(fù)進樣6針，計算RSD值，結(jié)果見表2。綠原酸、葫蘆巴堿、D-（-）-奎寧酸、咖啡酸峰面積的RSD值分別為0.32%、0.25%、0.56%、0.71%，表明在此試驗條件下儀器精密度良好。

2.1.3 重復(fù)性試驗。通過對咖啡生豆及焙炒咖啡豆供試品各6份測定綠原酸、葫蘆巴堿、D-（-）-奎寧酸、咖啡酸的含量，發(fā)現(xiàn)RSD值均小于1.0%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.1.4 穩(wěn)定性試驗。由表2可見，各成分RSD值均小于2%，表明咖啡溶液中綠原酸、葫蘆巴堿、D-（-）-奎寧酸、咖啡酸的含量在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.5 加樣回收試驗。由表3可知，綠原酸、葫蘆巴堿、D-（-）-奎寧酸、咖啡酸的回收率分別為97.12%、97.46%、95.25%、93.28 %，RSD值分別為1.77%、0.80%、2.23%、2.42%。表明該方法準(zhǔn)確、可靠，可用于咖啡中綠原酸、葫蘆巴堿、D-（-）-奎寧酸、咖啡酸的含量測定。

2.2 含量測定 由表4可知，綠原酸含量咖啡生豆中為30.54～38.15 mg/g，咖啡焙炒豆中為8.26～9.15 mg/g。在咖啡焙炒豆中葫蘆巴堿含量較咖啡生豆略有下降，下降幅度為0.43～1.15 mg/g?？Х榷怪蠨-（-）-奎寧酸和咖啡酸含量在經(jīng)過烘焙后也呈下降趨勢，其中生豆中D-（-）-奎寧酸含量為7.00～8.03 mg/g，咖啡酸含量為0.031～0.035 mg/g;焙炒豆中D-（-）-奎寧酸含量為2.27～4.79 mg/g，咖啡酸含量為0.011～0.012 mg/g。3個咖啡產(chǎn)區(qū)之間咖啡豆中咖啡酸含量差異不大;保山市較臨滄市及普洱市在綠原酸、葫蘆巴堿、D-（-）-奎寧酸含量均偏高，臨滄市、普洱市之間差異不大。

3 結(jié)論與討論

該試驗建立了云南小粒咖啡中綠原酸、葫蘆巴堿、D-（-）-奎寧酸和咖啡酸的高效液相色譜定量分析方法，該方法較回流提取法簡便、快速、高效，回收率高，各成分分離度良好，能較好地對綠原酸、葫蘆巴堿、D-（-）-奎寧酸、咖啡酸進行定性及定量分析。系統(tǒng)適應(yīng)性結(jié)果表明，該方法準(zhǔn)確、可靠，可以用于咖啡中此類成分的分析。

綠原酸是咖啡生豆的主要成分，咖啡生豆經(jīng)烘焙后，綠原酸含量明顯降低。這是由于綠原酸是由奎寧酸和肉桂酸（或咖啡酸、阿魏酸、香豆酸）形成的內(nèi)酯，其性質(zhì)不穩(wěn)定，在整個烘焙加熱過程中，綠原酸酯鍵斷裂，生成一系列非揮發(fā)性的內(nèi)酯和揮發(fā)性的酚類（如兒茶酚，愈創(chuàng)木酚等）[12]，使得綠原酸含量急劇下降。

3個咖啡產(chǎn)區(qū)之間咖啡豆中咖啡酸含量差異不大;保山市較臨滄市及普洱市在綠原酸、葫蘆巴堿、D-（-）-奎寧酸含量均偏高，臨滄市、普洱市之間差異不大，說明不同產(chǎn)地的小?？Х纫蛏L的海拔、氣候、土壤等不同，咖啡中化學(xué)成分含量存在差異。在進行不同地區(qū)的咖啡品質(zhì)評價時，增加綠原酸、葫蘆巴堿、咖啡酸、D-（-）-奎寧酸等指標(biāo)的評價，能更加客觀、科學(xué)、全面地分析咖啡豆的質(zhì)量品質(zhì)。

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