基于UHPLC—ESI—Q—TOFMS分析燈盞細(xì)辛提取物的血漿移行成分

王愛(ài)民

摘要 [目的]采用超高效液相色譜-電噴霧-四級(jí)桿-飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用（UHPLC-ESI-Q-TOF MS）研究燈盞細(xì)辛提取物中的入血成分。[方法]首先采用傳統(tǒng)中藥煎煮方法，制備燈盞細(xì)辛提取物；然后收集健康SD大鼠的含藥血漿，分別用甲酸水溶液和甲醇處理樣品后，采用UHPLC-ESI-Q-TOF MS并結(jié)合對(duì)照品，質(zhì)譜碎片信息和相關(guān)文獻(xiàn)，初步推測(cè)燈盞細(xì)辛提取物的血漿移行成分。[結(jié)果]通過(guò)與對(duì)照品比對(duì)并分析相關(guān)檢測(cè)數(shù)據(jù)，在含藥血漿中檢測(cè)到綠原酸、燈盞乙素、燈盞乙素苷元和燈盞甲素4種原型成分。[結(jié)論]該研究初步明確了燈盞細(xì)辛提取物可被吸收的物質(zhì)基礎(chǔ)，可為該藥在大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)研究提供依據(jù)。

關(guān)鍵詞 燈盞細(xì)辛提取物；血漿移行成分；UHPLC-ESI-Q-TOF MS

中圖分類(lèi)號(hào) S567；R284.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2018）02-0155-05

Abstract [Objective] The research aimed to study the ingredients of Erigeron breviscapus extract into the plasma of rats by UHPLCESIQTOF MS.[Method]Firstly，Erigeron breviscapus extract were prepared by the method of the traditional Chinese medicine decoction.Then，the plasma of healthy SD rats was collected and the samples were treated with formic acid aqueous solution and methanol respectively.Identification of ingredients of Erigeron breviscapus extract into the plasma of rats were performed by comparing the changes in molecular masses，retention times and full scan metabolisms （MS） spectra with those of the parent drug，and the relative data of authentic reference.[Result]Four prototype components of chlorogenic acid，scutellarin，scutellarin and apigenin7Oglucronide were detected in the drugcontaining plasma by comparing with the reference substance and analyzing the related test data.[Conclusion]The study initially identifies the material basis for the absorption of Erigeron breviscapus，which laid the basis for studying its pharmacokinetic in rats.

Key words Erigeron breviscapus extract；Plasma migration ingredients；UHPLCESIQTOF MS

燈盞細(xì)辛，又名燈盞花、細(xì)藥、踏地蓮花菜等，其因花似燈盞、根似細(xì)辛得名，為菊科植物短葶飛蓬[Erigeron breviscapus （Vant.） Hand.-Mazz.]的干燥全草[1-2]，主要分布于貴州、云南等地?！顿F州省中藥材、民族藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》稱(chēng)該品“辛溫，具有活絡(luò)止痛、祛風(fēng)除濕、散寒解表的功效，主治中風(fēng)偏癱、胸痹心痛等病癥，為貴州省少數(shù)民族用藥”。2015版《中國(guó)藥典》一部也予以記載[3]。研究發(fā)現(xiàn)，燈盞細(xì)辛中的黃酮和咖啡酸酯類(lèi)化合物是其特征性成分，也是治療腦血管疾病的活性成分[4]。但在對(duì)中藥的復(fù)雜成分研究中，很多成分體外有活性，體內(nèi)卻不能被吸收或入血前被代謝而未發(fā)揮體內(nèi)藥效。因此，首先確定中藥的體內(nèi)直接作用物質(zhì)才能為后續(xù)的藥物體內(nèi)過(guò)程、作用機(jī)制和生物轉(zhuǎn)化等研究提供理論參考。

筆者依據(jù)傳統(tǒng)中藥煎煮方法，對(duì)燈盞細(xì)辛進(jìn)行水煮濃縮簡(jiǎn)單提取，最大限度地保留原藥材中有效物質(zhì)；然后運(yùn)用

超高效液相色譜-電噴霧-四級(jí)桿-飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用（UHPLC-ESI-Q-TOF MS）對(duì)燈盞細(xì)辛提取物藥液以及含藥血漿進(jìn)行分析，通過(guò)與對(duì)照品比對(duì)并分析相關(guān)檢測(cè)數(shù)據(jù)，獲得試驗(yàn)大鼠口服燈盞細(xì)辛提取物后的血漿移行成分，明確燈盞細(xì)辛提取物可被吸收的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，為該藥在大鼠體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器設(shè)備。

UHPLC-Q-TOF（Agilent UHPLC系統(tǒng)，包括二元高壓梯度泵、自動(dòng)進(jìn)樣器，二極管陣列檢測(cè)器；Bruker MicroTOF-Q Ⅱ高分辨質(zhì)譜儀，配有電噴霧電離源，Compass1.2工作站）；真空玻璃干燥器（濟(jì)寧宏明化學(xué)試劑有限公司）；SHB-Ⅲ 循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司）；Water purifier實(shí)驗(yàn)室專(zhuān)用超純水機(jī)（沃特爾水處理設(shè)備有限公司）；Allegra 64R低溫高速離心機(jī)（美國(guó)Beckman Coulter公司）。

1.1.2 主要材料。燈盞乙素對(duì)照品（批號(hào) MUST-15042811，純度≥98%，北京恒元啟天化工技術(shù)研究院）；燈盞甲素對(duì)照品（批號(hào) D07-130912，純度≥98%，中國(guó)固體制劑制造技術(shù)國(guó)家工程研究中心）；燈盞乙素苷元對(duì)照品（批號(hào) MUST-15032012，純度≥98%，北京恒元啟天化工技術(shù)研究院）；綠原酸對(duì)照品（批號(hào) MUST -15042802，純度≥98%，北京恒天啟天化工技術(shù)研究院）；甲酸（色譜純，德國(guó)Merck公司）；甲醇（色譜純，德國(guó)Merck公司）；乙腈（色譜純，德國(guó)Merck公司）；蒸餾水（廣州屈臣氏有限公司）。

燈盞細(xì)辛藥材購(gòu)自云南省燈盞細(xì)辛藥材種植基地，由貴州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥用植物學(xué)與生藥學(xué)教研室龍慶德副教授鑒定為菊科植物短亭飛蓬[Erigenrm breviscapus（Vant.） Hand.-Mazz.]的干燥全草。

1.1.3 試驗(yàn)動(dòng)物。健康SD大鼠，雄性，體重為（280± 20）g，由重慶騰鑫生物技術(shù)有限公司提供，為清潔級(jí)動(dòng)物，動(dòng)物許可證號(hào)SCXK（渝）2012-0008。

飼養(yǎng)條件：購(gòu)入的大鼠進(jìn)入動(dòng)物室后，按每籠5只分裝。由專(zhuān)人飼養(yǎng)管理，以標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)并每日更換新鮮純凈水。動(dòng)物室光照充足，通風(fēng)良好，室溫18～25 ℃，相對(duì)濕度50%～70%，動(dòng)物飼養(yǎng)室按常規(guī)定期消毒。

1.2 方法

1.2.1 燈盞細(xì)辛提取物的制備。

依據(jù)傳統(tǒng)中藥煎煮方法，將燈盞細(xì)辛全草去泥，分別用10倍水煎煮3次，過(guò)濾并合并濾液，濃縮至浸膏狀，進(jìn)行微波真空干燥，將干燥物粉碎，即獲得燈盞細(xì)辛提取物。

1.2.2 液相條件。

Agilent Eclipse Plus C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm），流速為0.30 mL/min；柱溫為40 ℃，流動(dòng)相為0.1%甲酸乙腈（A）-0.1%甲酸水（B），進(jìn)樣體積為1 μL。梯度洗脫條件：0～11 min，4%～35%（A）；11～16 min，35%～5%（A）；16～17 min，5%～0（A）；17～18 min，0～4%（A）。

1.2.3 質(zhì)譜條件。電噴霧離子源（ESI），掃描方式為正負(fù)離子掃描（ESI-和ESI+，m/z 50～1 000），毛細(xì)管電壓3 kV，錐孔電壓80 V，離子源溫度110 ℃，霧化氣（N2）壓力1.2 bar，流速8.0 L/min，溫度200 ℃，脫溶劑氣溫度300 ℃，氣體體積流量50 L/h，脫溶劑氣體積流量550 L/h，準(zhǔn)確質(zhì)量測(cè)定采用甲酸鈉校正標(biāo)準(zhǔn)液，校正模式選用Enhanced Quadratic。質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集及處理軟件為Compass 1.2。

1.2.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制。

精密稱(chēng)取綠原酸10.08 mg、燈盞乙素9.51 mg、燈盞乙素苷元7.88 mg、燈盞甲素10.58 mg，用甲醇定容至10 mL，獲得綠原酸1.008 mg/mL、燈盞乙素0.951 mg/mL、燈盞乙素苷元0.788 mg/mL、燈盞甲素1.058 mg/mL的儲(chǔ)備液。分別精密量取綠原酸等4種對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，用甲醇按梯度稀釋成所需濃度，得混合系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，置于-20 ℃冰箱中保存，備用。

1.2.5 血漿樣品收集。

選取健康SD大鼠，通過(guò)灌胃給予燈盞細(xì)辛提取物溶液，給藥劑量為10 g/kg（按生藥量計(jì)算），給藥前24 h禁食，自由飲水。給藥30 min后通過(guò)股動(dòng)脈取血，將全血置涂有肝素鈉的塑料離心管中，離心（4 500 r/min，3 min），分離血漿，并置于-20 ℃冰箱中保存，直至分析。

1.2.6 血漿樣品處理方法。

取大鼠血漿1 mL，置于10 mL塑料離心管中，依次加入50 μL 1%甲酸，4 mL甲醇，手動(dòng)搖勻，超聲（10 min），離心（10 000 r/min，10 min），取上清液置于10 mL離心管，37 ℃下氮?dú)獯蹈?；再? mL甲醇，渦混，超聲（10 min），將溶液轉(zhuǎn)移至2 mL塑料離心管中，離心（12 000 r/min，5 min），取上清液置離心管中，37 ℃下氮?dú)獯蹈桑蛔詈笥?00 μL初始流動(dòng)相溶解，UHPLC-ESI-Q-TOF MS進(jìn)樣分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 燈盞細(xì)辛提取物的制備

制備的燈盞細(xì)辛提取物為棕褐色粉末狀，該提取物容易吸潮，需放置于真空玻璃干燥器中備用。該工藝的固形成分提取率達(dá)36%。

2.2 燈盞細(xì)辛提取物中入血成分的確認(rèn)

該試驗(yàn)采用內(nèi)標(biāo)校正法分別在正負(fù)兩種模式下進(jìn)行檢測(cè)分析，比較空白溶液、混合對(duì)照品溶液、燈盞細(xì)辛提取物溶液和含藥血漿的提取離子流色譜圖。從圖1～2可以看出，各成分間分離度良好，無(wú)明顯基質(zhì)干擾，且基線平穩(wěn)。

在相同色譜條件的負(fù)離子模式下，混合對(duì)照品溶液的色譜圖中綠原酸、燈盞乙素、燈盞甲素和燈盞乙素苷元分別在4.3、7.5、8.3和9.3 min出峰，而在燈盞細(xì)辛提取物和含藥血漿的色譜圖中相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)也能檢測(cè)到4個(gè)成分（圖1）。通過(guò)進(jìn)一步獲取4個(gè)成分的高分辨質(zhì)譜棒狀圖（圖3），以及各成分的高分辨數(shù)據(jù)（表1），結(jié)果顯示，含藥血漿、燈盞細(xì)辛提取物中各成分與對(duì)照品中已知化合物的出峰時(shí)間、離子碎片保持一致，并且各成分的質(zhì)量精度均在5 ppm以?xún)?nèi)，提示檢測(cè)結(jié)果在可信度范圍內(nèi)。

在相同色譜條件的正離子模式下，混合對(duì)照品溶液的色譜圖中綠原酸、燈盞乙素、燈盞甲素和燈盞乙素苷元也分別在4.3、7.5、8.3和9.3 min出峰，而在燈盞細(xì)辛提取物色譜圖的相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)也能檢測(cè)到4個(gè)成分（圖2）。由于綠原酸偏酸性，屬于質(zhì)子的給予體，導(dǎo)致其在正模式下的響應(yīng)較負(fù)模式下偏低，以致于在含藥血漿的色譜圖中幾乎檢測(cè)不到綠原酸，而其余成分在相應(yīng)保留時(shí)間點(diǎn)能夠檢測(cè)到。進(jìn)一步獲取各個(gè)成分的高分辨質(zhì)譜棒狀圖（圖4）和高分辨數(shù)據(jù)（表2），結(jié)果顯示，含藥血漿（除綠原酸以外）、燈盞細(xì)辛提取物中各成分與對(duì)照品中已知化合物的出峰時(shí)間、離子碎片保持一致，并且各成分的質(zhì)量精度均在5 ppm以?xún)?nèi)，提示檢測(cè)結(jié)果在可信度范圍內(nèi)。

3 討論

3.1 燈盞細(xì)辛提取方法的選擇

近年來(lái)的研究證實(shí)，中藥防治疾病的物質(zhì)基礎(chǔ)是多成分協(xié)同作用的綜合結(jié)果[5-6]。中藥材成分復(fù)雜，而在現(xiàn)代的中藥研究中，常常將原藥材進(jìn)行不同程度的提取精制，獲得特定的有效組分或單體后再進(jìn)行研究，這種研究思路使得目標(biāo)成分較明確，但也不同程度地導(dǎo)致其他有效成分的流失。關(guān)于燈盞細(xì)辛的炮制或服用方法在《滇南本草》《中國(guó)藥典》等藥材典籍中均記載為“以水煎服”。因此，該試驗(yàn)依據(jù)傳統(tǒng)中藥煎煮方法，對(duì)燈盞細(xì)辛進(jìn)行水煮濃縮簡(jiǎn)單提取。該方法既符合中藥傳統(tǒng)用藥習(xí)慣，又最大限度地保留了原藥材中的有效物質(zhì)。

3.2 入血成分試驗(yàn)方法的選擇

血清藥物化學(xué)是近年迅速發(fā)展起來(lái)的研究中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)較為科學(xué)的一種方法。該方法能夠防止中藥粗制劑或提取物本身理化性質(zhì)對(duì)試驗(yàn)干擾，通過(guò)模擬藥物體內(nèi)過(guò)程，實(shí)現(xiàn)體外試驗(yàn)的有效性，避免了直接體外試驗(yàn)可能得出的錯(cuò)誤結(jié)論[7]。因此，該試驗(yàn)選擇研究血漿中燈盞細(xì)辛提取物的原型成分，主要是為后續(xù)的藥代動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)提供理論依據(jù)。

3.3 血漿移行成分

該研究采用水煮濃縮法制備燈盞細(xì)辛提

取物，通過(guò)灌胃給予大鼠提取物后，能夠在其血漿中檢測(cè)綠原酸、燈盞乙素、燈盞乙素苷元以及燈盞甲素4個(gè)原型成分。結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道[8]，以上成分均具有清除自由基、抗氧化損傷的活性，提示綠原酸等4個(gè)化合物是燈盞細(xì)辛提取物中可被吸收的藥效物質(zhì)。

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