一株野生大型真菌的菌種分離及ITS序列鑒定

宋立志　馮連榮　梁德軍　矯麗曼　張妍

摘要 [目的]尋找適宜楊樹林下栽培的野生食用菌菌種。[方法]對(duì)采集自遼寧省阜新市蒙古族自治縣銀中楊林下的野生大型真菌進(jìn)行菌種分離，同時(shí)研究不同分離部位對(duì)菌絲生長的影響，并對(duì)獲得菌絲進(jìn)行了rDNA ITS序列分析。[結(jié)果]菌蓋與菌柄連接處為菌種最佳分離部位。對(duì)分離株rDNA ITS 片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物長度為692 bp，登錄NCBI與GenBank中已知的菌種進(jìn)行Blast比對(duì)，序列與Agaricus bitorquis（Quél.）Sacc的Query cover為97%～100%，ident均為99%。[結(jié)論]鑒定分離菌種為蘑菇科、蘑菇屬、大肥菇。該研究可為下一步開展楊-食用菌復(fù)合經(jīng)營提供菌種準(zhǔn)備。

關(guān)鍵詞 楊樹；野生大型真菌；菌種分離；ITS序列鑒定；大肥菇

中圖分類號(hào) S718.81 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2018）14-0113-03

Isolation and Identification of ITS Sequences of a Wild Macrofungi

SONG Lizhi， FENG Lianrong， LIANG Dejun et al

（Liaoning Institue of Poplar，Gaizhou， Liaoning 115213）

Abstract [Objective]To find suitable strains of wild edible fungi cultivated under poplar forests. [Method]Wild macrofungus under Populus alba forest collected from Mongolia Autonomous County， Fuxin City， Liaoning Province was isolated and the effects of different separation sites on mycelium growth were studied. The rDNA ITS sequences of mycelium were studied.[Result]The junction between the cap and stipe was the best separation site for the fungus. The rDNA ITS fragment was amplified by PCR， the length of the amplified product was 692 bp. The Blast comparison was performed between NCBI and a known strain in GenBank. The Query cover between sequence and Agaricus bitorquis（Quél.） Sacc was 97% to 100%， the idents were all 99%.[Conclusion]The identified strains belong to mushroom family， mushroom genus and Agaricus bitorquis.The study can provide the preparation of strains for the nest stage of poplaredible fungus compound management.

Key words Poplar；Wild macrofungi；Isolation of strains；ITS sequence identification；Agaricus bitorquis

我國是世界上楊樹人工林面積最大的國家[1]，其中遼寧省是我國楊樹發(fā)展的重要省份之一。但楊樹生產(chǎn)周期長、見效慢，直接經(jīng)濟(jì)效益來得晚而且很低，因此如何搞好林地綜合開發(fā)利用、找到林業(yè)經(jīng)濟(jì)增長點(diǎn)，是黨和各級(jí)政府關(guān)心的問題。近年來?xiàng)?糧[2-4]、楊-草[5-6]、楊-食用菌[7-10]等復(fù)合經(jīng)營成為楊樹產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要方向。食用菌作為一種傳統(tǒng)林副產(chǎn)品，非常適合林下栽培，成本低、收益高，楊-食用菌復(fù)合經(jīng)營近年來備受青睞。

根據(jù)林地條件，篩選適宜林下栽培的食用菌菌種，是林下食用菌栽培技術(shù)的重要組成部分，也是決定林下栽培食用菌成功與否的首要因素[11]。平原地區(qū)楊樹林下受環(huán)境條件限制，野生食用菌資源種類、數(shù)量遠(yuǎn)不及山區(qū)，所以尋找適宜楊樹林下栽培的食用菌品種至關(guān)重要。筆者從銀中楊林下采集一種野生大型真菌，對(duì)菌種進(jìn)行分離及鑒定，為下一步開展楊-食用菌復(fù)合經(jīng)營提供菌種準(zhǔn)備。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌種。

供試大型真菌子實(shí)體于2016年5月12日采自遼寧省阜新市阜新蒙古族自治縣銀中楊（Populus alba×P.berolinensis）樹下。阜新蒙古族自治縣氣候?qū)俦睖貛О敫珊导撅L(fēng)大陸性氣候區(qū)；多年平均日照數(shù)為2 865.5 h，年均氣溫7.2 ℃，≥10 ℃活動(dòng)積溫3 298.3 ℃，有效積溫1 607.3 ℃，無霜期150 d左右；年平均降水量500 mm左右，5—9月份降水量425 mm，占全年的85%。

1.1.2 培養(yǎng)基。

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂粉15 g，水1 000 mL，pH自然。稱取馬鈴薯200 g并切成1 cm2的小塊，放入水中煮沸20～30 min，用八層紗布進(jìn)行過濾，過濾后加入葡萄糖、瓊脂，繼續(xù)加熱攪拌混勻，稍冷卻后再補(bǔ)足水分至1 000 mL，分裝錐形瓶，121 ℃、0.15 MPa高壓滅菌20 min，備用。

1.1.3 酶及生化試劑。

Taq DNA 聚合酶，購自Thermo公司；TIANGEN DNAsecure新型植物基因組DNA提取試劑盒，購自北京天根生化科技有限公司；引物采用真菌通用引物ITS1、ITS4，由北京奧科鼎盛生物科技有限公司合成，引物序列為

ITS1：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′；ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′。

1.2 方法

1.2.1 菌種分離。

將采集的子實(shí)體用75%乙醇輕輕擦拭2～3遍，在超凈工作臺(tái)中，將子實(shí)體沿菌蓋中央輕輕掰開，用解剖刀分別在子實(shí)體菌柄、菌蓋及菌柄與菌蓋交界處取6 mm左右的菌肉接種至PDA平板培養(yǎng)基中，每個(gè)平皿接種1塊菌肉，重復(fù)5次，用封口膜封口后于25 ℃條件下培養(yǎng)，每天觀察菌絲生長情況。當(dāng)有菌絲長滿平皿時(shí)結(jié)束培養(yǎng)，采用十字交叉法測(cè)量菌絲直徑，計(jì)算菌絲日均生長速度（mm/d）。

1.2.2 菌絲DNA提取及凝膠電泳檢測(cè)。

將分離得到的菌種命名為FM512，接種到PDA平板培養(yǎng)基中，25 ℃下靜置培養(yǎng)7 d后，刮取菌落邊緣的新鮮菌絲，使用DNAsecure新型植物基因組DNA提取試劑盒進(jìn)行基因組DNA提取，具體操作按說明書進(jìn)行，將提取的DNA置于-20 ℃保存?zhèn)溆?。? μL提取的DNA經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，用Syngene G：BOX凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行拍照。

1.2.3 ITS-PCR擴(kuò)增及序列比對(duì)。

以基因組DNA為模板，應(yīng)用真菌通用引物對(duì)ITS1和ITS4進(jìn)行PCR擴(kuò)增，ITS-PCR擴(kuò)增體系為10×PCR Buffer 2.5 μL，dNTP（2.5 mmol/L）2 μL，引物（10 μmol/L）0.5 μL，Taq DNA 聚合酶（5 U/μL）0.25 μL，模板DNA 1 μL，用ddH2O補(bǔ)足至25 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，共30個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min，終止溫度為4 ℃。反應(yīng)結(jié)束后取6 μL產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后送至TaKaRa寶生物工程（大連）有限公司進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果登錄GenBank進(jìn)行Blast（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi？PROGRAM=blastn&PAGE_TYPE=BlastSearch&LINK_LOC=blasthome）比對(duì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 子實(shí)體形態(tài)特征

對(duì)采集的子實(shí)體形態(tài)特征（圖1）描述如下：子實(shí)體大，菌蓋直徑7.5 cm，扁半球形，頂部略下凹，白色；邊緣內(nèi)卷，無鱗片；菌肉白色，厚，緊密，菌褶白色，后變粉紅色到黑褐色，離生，不等長；菌柄短，粗壯，5.0 cm×3.0 cm，白色，內(nèi)實(shí)，近圓柱形；菌環(huán)雙層，白色，膜質(zhì)，生菌柄中部；孢子印深褐色，孢子褐色。

2.2 子實(shí)體不同部位對(duì)分離的影響

將FM512從子實(shí)體的不同部位進(jìn)行分離培養(yǎng)，3個(gè)部位的菌絲在生長速度上有一定差異（表1），其中菌柄菌蓋交界處菌絲生長快于菌蓋、菌柄處，3個(gè)處理菌絲長勢(shì)和菌絲濃密程度差異不大（圖2）。

2.3 菌絲DNA提取及ITS-PCR擴(kuò)增

將提取的DNA經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)（圖3），DNA條帶清晰、較明亮，無明顯后拖尾現(xiàn)象，說明基因組DNA完整，可以作為PCR反應(yīng)的模板。以DNA為模板，ITS1、ITS4為引物對(duì)rDNA ITS區(qū)段PCR擴(kuò)增，結(jié)果顯示片段大小約為700 bp（圖4），與預(yù)期結(jié)果一致。

2.4 序列比對(duì)

rDNA ITS區(qū)段序列測(cè)定結(jié)果顯示，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長度為692 bp，測(cè)序結(jié)果登錄NCBI經(jīng)Blast比對(duì)，結(jié)果表明，與FM512相似性最高前10位的菌株均為Agaricus bitorquis（Quél.）Sacc，Query cover為97%～100%，ident均為 99%，確定FM512為Agaricus bitorquis（大肥菇）。

3 結(jié)論與討論

對(duì)于野生食用菌的鑒定，判斷所獲得無性培養(yǎng)菌絲是否是從原子實(shí)體分離獲得，單從菌絲的形態(tài)不能完全準(zhǔn)確進(jìn)行判斷。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，國際核酸庫信息資源不斷豐富，ITS等分子鑒定手段逐漸被人們關(guān)注。將ITS序列與GenBank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行Blast檢索比對(duì)，序列相似性≥99%，可以鑒定為相同種[12]。筆者對(duì)采自阜新蒙古族自治縣銀中楊林下的野生大型真菌FM512進(jìn)行了組織分離，適宜分離部位菌蓋和菌柄交界處優(yōu)于菌蓋、菌柄處。對(duì)獲得的菌絲進(jìn)行了ITS-PCR擴(kuò)增，經(jīng)序列比對(duì)鑒定FM512為大肥菇，屬擔(dān)子菌亞門（Basidiomycotina）、層菌綱（Hymenomycetes）、傘菌目（Agaricales）、蘑菇科（Agaricaceae）、蘑菇屬（Agaricus）。

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