響應(yīng)面法優(yōu)化樹舌靈芝多糖提取工藝

杜鵬瑤 王麗紅 劉德江 張?jiān)平?/p>

摘要 [目的]探討熱水提取法提取樹舌靈芝多糖（soluble polysaccharides from Ganoderma applanatum，GASP）的最佳提取工藝。[方法]在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，運(yùn)用響應(yīng)面法對(duì)提取的樹舌靈芝多糖（GASP）各項(xiàng)參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。[結(jié)果]提取時(shí)間、提取溫度、液料比均對(duì)樹舌靈芝多糖提取率有顯著影響，影響大小為提取時(shí)間>液料比>提取溫度;最終確定樹舌靈芝多糖提取的最佳工藝條件為提取溫度77 ℃、提取時(shí)間138 min、液料比27∶1（mL∶g），該條件下多糖實(shí)際提取率為2.57%±0.05%。[結(jié)論]響應(yīng)面法優(yōu)化樹舌靈芝多糖提取工藝參數(shù)切實(shí)可靠。

關(guān)鍵詞 樹舌靈芝;多糖;提取;響應(yīng)面

中圖分類號(hào) R284.2文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A文章編號(hào) 0517-6611（2018）34-0148-04

樹舌靈芝[Ganoderma applanatum （Pers.） Pat]別名樹舌、樹舌扁靈芝、平蓋靈芝，隸屬于擔(dān)子菌門（Basidiomycota）非褶菌目（Aphyllophorales）靈芝菌科（Ganodermataceae）靈芝屬（Ganoderma Karst），是藥食同源的大型高等真菌[1]。我國(guó)大部分省區(qū)均有分布[2]，且廣泛分布于歐洲、亞洲、北美洲等地區(qū)的其他國(guó)家[3]。樹舌靈芝藥用見于《中國(guó)藥用真菌圖鑒》和《長(zhǎng)白山植物藥志》，其性平，微苦，能抗癌、止痛、清熱、化積、止血、化痰、消炎解毒[4]。研究表明，樹舌靈芝還具調(diào)節(jié)免疫力、抗腫瘤、保肝、抗菌、抗病毒、抗氧化、降血壓等生物活性[5-11]。多糖作為一種天然高分子化合物，具有廣泛的生物活性，近年來受到廣大學(xué)者們的重視。而樹舌靈芝多糖（soluble polysaccharides from Ganoderma applanatum，GASP）作為樹舌靈芝的活性成分之一，也受到醫(yī)藥工作者的重視，關(guān)于其報(bào)道也最多。

目前提取多糖常用的方法有水提法、超聲提取法、微波提取法、酶提取法、超臨界流體萃取法、酸提法、堿提法等[12-14]。而水提法是實(shí)驗(yàn)室提取多糖最常用的方法之一，該方法具有經(jīng)濟(jì)環(huán)保、操作簡(jiǎn)單、對(duì)設(shè)備要求低等優(yōu)點(diǎn)。最重要的是與其他方法相比，對(duì)天然活性物質(zhì)的結(jié)構(gòu)影響小，因此被廣泛應(yīng)用于包括多糖的水溶性活性成分的提取研究[15]。筆者采用熱水提取法對(duì)樹舌靈芝多糖（GASP）進(jìn)行提取，并在提取條件單因素的基礎(chǔ)上進(jìn)行響應(yīng)面法優(yōu)化，以確定水提樹舌靈芝多糖最佳提取工藝，為樹舌靈芝多糖規(guī)?；_發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

樹舌靈芝采至黑龍江省佳木斯市湯原縣鷹山，經(jīng)佳木斯大學(xué)生藥學(xué)教研室王麗紅教授鑒定為樹舌靈芝（Ganoderma applanatum）。試驗(yàn)所用葡萄糖、濃硫酸、苯酚、乙醇均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.2 儀器與設(shè)備

FW135中草藥粉碎機(jī)（天津市泰斯特儀器有限公司）;FA2004N型電子分析天平（上海恒平科學(xué)儀器有限公司）;HH-24型恒溫水浴鍋（鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司）;UV-2550型紫外可見分光光度計(jì)（島津公司）。

1.3 方法

1.3.1 樹舌靈芝多糖的提取。

取清洗過后的樹舌靈芝子實(shí)體放至烘箱，50 ℃烘干至恒重，粉碎過40目篩，制得樹舌靈芝干粉。精密稱取樹舌干粉3.0 g，用80%乙醇浸泡24 h，乙醇用量剛好沒過料面即可，抽濾，80%乙醇洗脫濾渣至濾液澄清，自然晾干。按試驗(yàn)方案所需液料比、提取溫度、提取時(shí)間、提取次數(shù)進(jìn)行提取，抽濾，離心，濃縮至固定體積，所得溶液即為樹舌靈芝粗多糖提取液。

1.3.2 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。

精密稱取干燥恒重的標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖10 mg，定容于100 mL容量瓶中，配制成濃度為0.1 mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。精密移取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液，分別置于具塞試管中，依次加水定容至2 mL，另取2.0 mL蒸餾水作空白對(duì)照。然后加入1.0 mL濃度5%的苯酚溶液，搖勻，迅速加入5 mL濃硫酸，搖勻后待試管冷卻至室溫即可。在波長(zhǎng)490 nm處測(cè)定吸光值，以所測(cè)吸光值為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并求出線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)。

1.3.3 粗多糖含量及提取率的測(cè)定? 。

將所得粗多糖溶液稀釋至適當(dāng)倍數(shù)后得樣品溶液，精密移取樣品溶液2 mL，按測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法測(cè)定吸光度，由回歸方程計(jì)算樹舌靈芝粗多糖溶液中多糖的濃度，按下式計(jì)算樹舌靈芝粗多糖溶液中多糖的含量：多糖含量（m0）=C·V·X;多糖得率（%）=m0/m×100%。式中，C為樣品溶液中多糖的濃度（mg/mL），V為樣品溶液體積（mL），X為稀釋倍數(shù)，m為樹舌靈芝干重（g），m0為多糖含量（mg）。

1.4 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.4.1 液料比對(duì)樹舌靈芝多糖提取率的影響。

準(zhǔn)確稱取6份質(zhì)量相同的樹舌靈芝干粉3.0 g，按樹舌靈芝粗多糖提取工藝流程“1.3.1”進(jìn)行操作，設(shè)置液料比為15∶1、25∶1、35∶1、45∶1、55∶1、65∶1（mL∶g，下同），在70 ℃條件下浸提2 h，提取3次，根據(jù)所測(cè)吸光度考察液料比對(duì)樹舌靈芝粗多糖得率的影響。

1.4.2 提取溫度對(duì)樹舌靈芝多糖提取率的影響。

準(zhǔn)確稱取6份質(zhì)量相同的3.0 g靈芝干粉末，按樹舌靈芝粗多糖提取工藝流程進(jìn)行操作，按液料比 45∶1加入蒸餾水，設(shè)置提取溫度分別為50、60、70、80、90、100 ℃，浸提2 h，提取3次。根據(jù)所測(cè)吸光度考察提取溫度對(duì)樹舌靈芝多糖提取率的影響。

1.4.3 提取時(shí)間對(duì)樹舌靈芝多糖提取率的影響。

準(zhǔn)確稱取6份質(zhì)量相同的5 g靈芝干粉末，按液料比45∶1加入蒸餾水，設(shè)置提取時(shí)間分別為30、60、90、120、150、180 min，在70 ℃條件下提取3次，根據(jù)所測(cè)吸光度考察提取時(shí)間對(duì)樹舌靈芝粗多糖得率的影響。

1.4.4 提取次數(shù)對(duì)樹舌靈芝多糖提取率的影響。

準(zhǔn)確稱取6份質(zhì)量相同的5 g靈芝干粉末，按液料比45∶1加入蒸餾水，設(shè)置提取次數(shù)分別為1、2、3、4次，在70 ℃條件下浸提2 h。根據(jù)所測(cè)吸光度考察提取次數(shù)對(duì)樹舌靈芝粗多糖得率的影響。

1.5 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

通過單因素試驗(yàn)確定各因素變量范圍，選擇提取溫度（A）、提取時(shí)間（B）及液料比（C）為主要影響因素。運(yùn)用Design Expert 8.0軟件進(jìn)行3因素3水平Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)，試驗(yàn)因素及水平編碼如表1所示。根據(jù)公式（1）計(jì)算出多元二次回歸數(shù)學(xué)模型，進(jìn)行數(shù)據(jù)回歸分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線線性考察結(jié)果

根據(jù)葡萄糖對(duì)照品濃度（C）與吸光度值（A）的線性關(guān)系得回歸方程A=67.428 57C-0.112 19，R2=0.999 5，說明葡萄糖濃度與吸光度值的線性關(guān)系良好。

2.2 單因素結(jié)果分析

2.2.1 液料比對(duì)樹舌靈芝多糖提取率的影響。

由圖1可知，液料比在15∶1～35∶1范圍內(nèi)，GASP提取率與液料比呈正相關(guān);在35∶1時(shí)最大，提取率可達(dá)2.18%;而液料比超過35∶1以后，隨著液料比的增大GASP提取率呈下降趨勢(shì)。這可能是因?yàn)樵谝欢ǚ秶鷥?nèi)，隨著液料比的增大可以提高植物細(xì)胞內(nèi)外溶劑的濃度差，從而使水溶性多糖迅速溶出從而提高多糖提取率[16]，但液料比達(dá)到一定值后，液料比太大，濃縮時(shí)間延長(zhǎng)，導(dǎo)致多糖損失[17]。綜合考慮，選擇35∶1為BBD（Box-Behnken Design）試驗(yàn)液料比的中心點(diǎn)。

2.2.2 提取溫度對(duì)樹舌靈芝多糖提取率的影響。

由圖2可知，在一定提取范圍內(nèi)，GASP提取率隨著提取溫度的升高而增大，提取溫度在80 ℃時(shí)GASP提取率最高可達(dá)2.05%;提取溫度超過80 ℃以后，隨著溫度的升高GASP提取率呈下降趨勢(shì)。這可能因?yàn)闇囟壬仙揭欢ㄋ綍r(shí)，由溫度過高引起部分多糖結(jié)構(gòu)破壞而降解[18]，從而使GASP提取率降低。因此選擇80 ℃為BBD試驗(yàn)提取溫度的中心點(diǎn)。

2.2.3 提取時(shí)間對(duì)樹舌靈芝多糖提取率的影響。

圖3表明，GASP提取率隨著溫度的升高呈先上升后下降的趨勢(shì)，在120 min時(shí)達(dá)到峰值2.08%。這可能因?yàn)樘幚頃r(shí)間太短，樣料中的多糖不能充分溶解;而時(shí)間太長(zhǎng)，會(huì)使多糖降解為各種單糖，導(dǎo)致提取率下降[19]。因此選擇120 min為BBD試驗(yàn)提取時(shí)間的中心點(diǎn)。

2.2.4 提取次數(shù)對(duì)樹舌靈芝多糖提取率的影響。由圖4可以看出，GASP提取率隨著提取次數(shù)的增加而提高，提取次數(shù)從1次增加到3次，GASP提取率從1.13%增加到2.11%，增幅比較明顯，從3次到5次提取率幾乎趨于穩(wěn)定。綜合考慮，為節(jié)約資源，簡(jiǎn)化操作，確定BBD試驗(yàn)提取次數(shù)的中心點(diǎn)為3次。

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果分析

2.3.1 Box-Behnken模型建立及試驗(yàn)結(jié)果。

通過響應(yīng)面設(shè)計(jì)Box-Behnken對(duì)GASP提取率建立數(shù)學(xué)模型，優(yōu)化提取工藝參數(shù)，共有17個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)，12個(gè)分析因子，5個(gè)零點(diǎn)。以分析因子為自變量在A、B、C構(gòu)成三維頂點(diǎn);零點(diǎn)為區(qū)域的中心點(diǎn)。零點(diǎn)試驗(yàn)重復(fù)5 次，用以估算試驗(yàn)誤差[20]。以GASP提取率為響應(yīng)值，試驗(yàn)結(jié)果見表2。

2.3.2 響應(yīng)面回歸模型的建立及顯著性檢驗(yàn)。

運(yùn)用Design-expert 8.0軟件對(duì)表2中的GASP提取率進(jìn)行回歸分析，建立回歸模型。根據(jù)公式（1），得GASP提取率回歸方程（編碼方程）為：Y=2.54+0.10×A+0.38×B-0.32×C-0.12×A×B+0.33×A×C-0.23×B×C-0.38×A2-0.50×B2-0.36×C2。

模型的F值為49.3 P<0.000 1**，表明該試驗(yàn)所得擬合方程回歸模型具有高度顯著性。失擬項(xiàng)P>0.05，不顯著，表明該模型的穩(wěn)定性較好;調(diào)整決定系數(shù)R2=0.984 5，表明GASP提取率約98.45%是由獨(dú)立變量決定;決定系數(shù)R2Adj=0.964 5，變異系數(shù)C.V.%=5.50%，表明該模型的相關(guān)性高，擬合度較好，能很好地模擬GASP真實(shí)提取率與各變量之間的關(guān)系。概率值P<0.05說明該模型項(xiàng)是顯著的;P<0.01說明該模型項(xiàng)為極其顯著。根據(jù)回歸模型方差分析可知：FA=7.18，PA=0.031 5*;FB=98.06，PB<0.000 1**;FC=68.21，PC<0.000 1**;FAB=4.99，PAB=0.060 7;FAC=37.67，PAC=0.000 5**;FBC=18.54，PBC=0.003 5**;FA2=51.54，PA2=0.000 2**;FB2=89.46，PB2=0.000 1**;FC2=46.77，PC2=0.000 2**。可見，A為顯著項(xiàng);B、C、AC、BC、A2、B2 、C2均為極顯著項(xiàng)。

2.3.3 等高線圖及響應(yīng)面圖分析。

為比較直觀地了解各因素之間交互作用是否顯著，以期進(jìn)一步優(yōu)化試驗(yàn)工藝，運(yùn)用Design-expert 8.0軟件對(duì)GASP提取率響應(yīng)值分析作圖，得到由響應(yīng)值、A、B、C因素所構(gòu)成的三維空間圖及其三維空間在二維平面上的等高線圖，分析結(jié)果見圖5～7。

由圖5中的三維空間圖可知，該試驗(yàn)在所選范圍內(nèi)存在極值，既是三維曲面的最高點(diǎn)，又是等高線圖橢圓的中心點(diǎn)。與A方向比較，B方向的效應(yīng)面曲線較陡，B等高線的密度顯著高于沿A方向移動(dòng)的密度，說明提取時(shí)間（B）對(duì)GASP提取率的影響顯著高于提取溫度（A）;等高線呈圓形，表明提取時(shí)間（B）與提取溫度（A）的交互作用不顯著。

由圖6可以看出，與A方向比較，C方向的效應(yīng)面曲線較陡，C等高線的密度顯著高于沿A方向移動(dòng)的密度，說明液料比（C）對(duì)GASP提取率的影響顯著高于提取溫度（A）;等高線呈橢圓形，表明液料比（C）與提取溫度（A）的交互作用顯著。

由圖7可以看出，與C方向比較，B方向的效應(yīng)面曲線較陡，B等高線的密度顯著高于沿C方向移動(dòng)的密度，說明提取時(shí)間（B）對(duì)GASP提取率的影響顯著高于液料比（C）;等高線呈橢圓形，表明提取時(shí)間（B）與液料比（C）的交互作用顯著。因此，各因素對(duì)GASP提取率影響大小為提取時(shí)間（B）>液料比（C）>提取溫度（A）。

2.3.4 響應(yīng)面模型驗(yàn)證。

根據(jù)所得到的模型，預(yù)測(cè)最佳提取工藝條件為提取溫度77.04 ℃、提取時(shí)間137.91 min、液料比27.33∶ 在該條件下GASP提取率的理論值可達(dá)2.76%。考慮到試驗(yàn)的實(shí)際操作性，將提取條件修正為提取溫度77 ℃、提取時(shí)間138 min、液料比27∶1。試驗(yàn)重復(fù)3次，所得GASP實(shí)際提取率為2.57%±0.05%，該結(jié)果與理論值較為吻合。

3 結(jié)論

該研究在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，運(yùn)用Box-Benhnken響應(yīng)面法對(duì)樹舌靈芝多糖的提取條件進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果表明：提取溫度、提取時(shí)間、液料比均對(duì)樹舌靈芝多糖提取率有顯著影響，影響大小為提取時(shí)間>液料比>提取溫度;最終確定樹舌靈芝多糖提取的最佳工藝條件為提取溫度77 ℃、提取時(shí)間138 min、液料比27∶ 在該條件下多糖實(shí)際提取率為2.57%±0.05%?？梢姡\(yùn)用響應(yīng)面法優(yōu)化樹舌靈芝多糖提取工藝參數(shù)切實(shí)可靠，為樹舌靈芝多糖的開發(fā)利用奠定了理論基礎(chǔ)。

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