草銨膦對(duì)油菜種子萌發(fā)和根尖細(xì)胞遺傳毒性的影響

周文濤

摘要 [目的]探討草銨膦對(duì)油菜種子萌發(fā)和根尖細(xì)胞遺傳毒性的影響。[方法]模擬不同濃度和處理時(shí)間下，低劑量草銨膦殘留對(duì)甘藍(lán)型油菜萌發(fā)后幼苗生長(zhǎng)初期的生長(zhǎng)發(fā)育和根尖細(xì)胞分裂活動(dòng)的影響。[結(jié)果]草銨膦處理對(duì)油菜發(fā)芽期幼苗下胚軸、初生根等性狀的抑制效果隨處理濃度的升高和處理時(shí)間的延長(zhǎng)而增強(qiáng)；0.000 01%的草銨膦殘留即可對(duì)油菜地上部分和地下部分產(chǎn)生明顯的抑制效果，下胚軸對(duì)草銨膦的敏感性顯著大于初生根；0.005%的草甘膦處理根尖4 h可顯著抑制油菜根尖分生區(qū)細(xì)胞的有絲分裂，其抑制作用隨濃度的升高和處理時(shí)間的延長(zhǎng)逐步增強(qiáng)，并可誘發(fā)細(xì)胞產(chǎn)生染色體橋、染色體落后、多級(jí)分裂、間期微核、染色體濃縮等染色體變異。[結(jié)論]試驗(yàn)結(jié)果為草銨膦在油菜田使用的安全性評(píng)估提供了理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞 油菜；草銨膦；種子萌發(fā)；染色體變異；有絲分裂

中圖分類號(hào) S482.4 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2018）02-0120-04

Abstract [Objective] The aim was to study the effects of herbicide glufosinate on seedling growth and morphological root tips cell genetic toxicity on Brassica napus. [Method] Under the conditions of different concentrations and different treatment duration， effects of herbicide glyphosate on seed germination and morphological root tips division activity of Brassica napus were studied. [Result] The inhibitive effects of glufosinate treatments on rapeseed hypocoty and primary root morphological characters were enhanced along with the increase of treatment concentrations and durations. The 0.000 01% glufosinate could inhibit the growth of hypocoty significantly. The inhibitive effects of glufosinate treated for hypocotyl was significantly greater than primary root；the mitosis in root tip cells treated by the 0.005% glufosinate for 4 h could be significantly inhibited， and its inhibition effects were enhanced along with the increase of treatment concentrations and durations， and induced cells to produce chromosome bridge， chromosome lagging， multilevel division， interphase micronucleus， chromosome enrichment genetic effect， etc.. [Conclusion] The results provide reference for safety assessment of glufosinate applied in Brassica napus field.

Key words Rapeseed；Glufosinate；Seed germination；Chromosome disorder；Mitosis

油菜是世界主要的經(jīng)濟(jì)作物之一。隨著高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)油菜品種的培育和推廣，油菜種植面積不斷擴(kuò)大，油菜田雜草發(fā)生也呈逐年上升趨勢(shì)。目前，油菜田雜草以化學(xué)防除為主。草銨膦（Glufosinate）是一種廣譜非選擇性的除草劑，其對(duì)植物的地上部分和地下部分均有殺死作用[1]，屬滅生性莖葉處理劑[2]，靶標(biāo)酶為谷氨酰胺合成酶（GS）[3]，草銨膦抑制GS可以導(dǎo)致植物體內(nèi)氮代謝失調(diào)，必需氨基酸的合成受阻，從而降低肽、蛋白質(zhì)與核苷酸生物合成，光合作用受抑制，最終導(dǎo)致植物死亡[4]。草銨磷由于具有活性高、藥效快、非選擇性、無(wú)土壤活性等優(yōu)點(diǎn)[5]，越來(lái)越被人們接受，并廣泛應(yīng)用。正是由于草銨膦的非選擇性，在殺死雜草的同時(shí)也影響了農(nóng)作物的正常生長(zhǎng)發(fā)育，所以草銨膦對(duì)作物生長(zhǎng)的影響的研究顯的尤為重要。根尖是萌發(fā)種子在土壤中首先接觸除草劑的器官，張帆等[6]研究發(fā)現(xiàn)新型除草劑丙酯草醚抑制發(fā)芽期油菜的苗高、根長(zhǎng)、側(cè)根數(shù)、干物質(zhì)積累等，并且抑制根尖細(xì)胞的有絲分裂。若要在直播油菜田推廣應(yīng)用，需要評(píng)價(jià)其對(duì)發(fā)芽期油菜幼苗的安全性問(wèn)題。化學(xué)除草雖然高效，但在實(shí)際使用中會(huì)對(duì)主栽作物產(chǎn)生影響或有藥物殘留，如何使其對(duì)主栽品種的藥害降到最低，對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的影響減到最小，成為目前亟待解決的問(wèn)題[7]。

筆者通過(guò)形態(tài)學(xué)方法研究了微量濃度草銨膦對(duì)油菜幼苗根莖長(zhǎng)、側(cè)根數(shù)等性狀的影響，并進(jìn)一步通過(guò)根尖壓片法對(duì)草銨膦的細(xì)胞學(xué)毒性進(jìn)行了觀察，研究了草銨膦殘留毒性對(duì)后茬油菜幼苗生長(zhǎng)的影響，旨在為草銨膦在油菜田使用的安全性評(píng)估提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)材料。甘藍(lán)型油菜（Brassica napus L.）中雙11號(hào)，由西南大學(xué)油菜工程技術(shù)中心提供。選取種皮光亮、飽滿的種子，播于鋪有2層定性濾紙的直徑6 mm的培養(yǎng)皿內(nèi)，每皿30粒，置于光照培養(yǎng)箱中使其萌發(fā)，溫度26 ℃，光照16 h，黑暗8 h。

1.1.2 供試藥劑。

草銨膦：永農(nóng)牌百速頓草銨膦，永農(nóng)生物科學(xué)有限公司生產(chǎn)（產(chǎn)地：中國(guó)浙江）。有效成分含量為200 g/L。

1.2 方法

1.2.1 除草劑對(duì)地上和地下部分形態(tài)性狀的影響試驗(yàn)。播種后分別用有效含量為0.000 01%、0.000 10%、0.001 00%、0.010 00%的草銨膦水溶液使其萌發(fā)，分別處理1、2、3、4、5 d，以去離子水為對(duì)照，每處理設(shè)10次重復(fù)，6 d后選取長(zhǎng)勢(shì)均勻的10株幼苗，測(cè)量下胚軸和初生根長(zhǎng)度，統(tǒng)計(jì)側(cè)根數(shù)。

1.2.2 除草劑對(duì)根尖細(xì)胞分裂的影響試驗(yàn)。用清水進(jìn)行種子萌發(fā)，待其初生根長(zhǎng)至1.0 cm左右時(shí)分別用有效含量為0.005%、0.010%、0.050%、0.100%、0.500%、1.000%的草銨膦溶液浸根，每個(gè)濃度分別處理4、8、12、16、20、24 h，以清水作為對(duì)照，采用卡諾氏固定液固定24 h，根尖保存于70%乙醇中。用去離子水將保存的根尖沖洗干凈，置于1 mol/L HCl中，60 ℃水浴中解離6 min后用去離子水沖洗干凈，卡寶品紅染色，壓片，在光學(xué)顯微鏡下觀察記錄根尖分生組織細(xì)胞有絲分裂指數(shù)和各種異常細(xì)胞出現(xiàn)頻數(shù)并照像，每處理組觀察4個(gè)根尖，每個(gè)根尖觀察約2 000個(gè)細(xì)胞。

1.3 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)及制圖使用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件和Excel 2007軟件進(jìn)行，采用LSD法分析差異顯著性。有絲分裂指數(shù)（MI）=分裂期細(xì)胞總數(shù)/觀察細(xì)胞總數(shù)×100%[8-9] 。

2 結(jié)果與分析

2.1 草銨膦對(duì)油菜幼苗生長(zhǎng)發(fā)育的影響

草銨膦對(duì)油菜幼苗地下和地上部分均有抑制作用（表1和圖1），其抑制效果隨處理濃度的升高和處理時(shí)間的延長(zhǎng)而增強(qiáng)；在0.000 01%草銨膦處理下，處理后1 d地上部分下胚軸的長(zhǎng)度受到了顯著抑制，而0.000 01%草銨膦即使處理5 d后也未能引起地下部分初生根根長(zhǎng)的顯著變化，0.000 10%草胺膦處理4 d后地下部分初生根才受到明顯抑制，相比之下，地上部分對(duì)草銨膦更敏感；側(cè)根數(shù)從處理1 d后開(kāi)始就受到了明顯抑制，0.001 00%草胺膦處理4 d后已完全抑制了側(cè)根的發(fā)生；下胚軸/初生根長(zhǎng)在低濃度（0.000 01%～0.001 00%）草銨膦短時(shí)間（1～3 d）處理下與對(duì)照無(wú)顯著差異（圖2），表明在試驗(yàn)濃度和處理時(shí)間下，草銨膦對(duì)地上部分和地下部分的抑制作用大致相同。0.000 10%草銨膦處理5 d后，下胚軸/初生根長(zhǎng)達(dá)到最大值（2.20），之后隨濃度的增加而下降。

2.2 草銨膦對(duì)油菜根尖細(xì)胞遺傳毒性的影響

2.2.1 草銨膦處理對(duì)油菜幼苗根尖有絲分裂的影響。

用不同濃度和不同時(shí)間的草銨膦處理油菜幼苗根尖，對(duì)其分生組織進(jìn)行壓片觀察。結(jié)果表明，草甘膦能顯著影響根尖細(xì)胞的有絲分裂指數(shù)，用不同濃度的草銨膦處理后，細(xì)胞有絲分裂指數(shù)與對(duì)照相比均有不同程度的降低，表明有絲分裂活動(dòng)受到抑制。當(dāng)濃度為0.005%時(shí)，有絲分裂指數(shù)在3.42%～1.63%；濃度為0.010%時(shí)，有絲分裂指數(shù)在2.29%～0.82%；濃度為0.050%時(shí)，有絲分裂指數(shù)在1.40%～0.81%；濃度為0.100%時(shí)，有絲分裂指數(shù)在0.75%～0.29%；濃度為0.500%時(shí)，有絲分裂指數(shù)在0.30%～0.05%；隨著處理濃度的增加，有絲分裂指數(shù)逐漸下降，也就是說(shuō)，有絲分裂活動(dòng)受到的抑制作用更明顯（圖3）。

2.2.2 草銨膦對(duì)油菜根尖細(xì)胞毒害作用的異常細(xì)胞形態(tài)觀察。

油菜幼苗期根尖經(jīng)草甘膦處理后，在處理組均檢測(cè)到了多種異常有絲分裂[10]的細(xì)胞，如染色體橋、滯后染色體、微核、斷裂染色體、多級(jí)、染色體黏連、染色體濃縮等現(xiàn)象，其中染色體橋是最容易觀察到的現(xiàn)象（圖4）。橋是由于2條染色體斷裂后融合形成的，當(dāng)2條染色體的著絲粒已經(jīng)分別移向相對(duì)的兩極時(shí)，二者的臂仍然黏連在一起，形成后期的橋，染色體橋可以導(dǎo)致染色體結(jié)構(gòu)的變異，該試驗(yàn)中觀察到的染色體橋有單橋、雙橋、三橋和多橋等類型。該研究發(fā)現(xiàn)，0.005%草銨膦處理4 h即可引起染色體畸變，當(dāng)濃度增大到1.000%時(shí)，各處理時(shí)間段均未在分裂期細(xì)胞里觀察到畸變?nèi)旧w，染色體畸變率在0～15.63%，這些異常有絲分裂的細(xì)胞在CK中均未觀察到。

3 結(jié)論與討論

草銨膦是廣譜、苗后、非選擇性除草劑，它通過(guò)對(duì)GS不可逆抑制，造成植物氮代謝失調(diào)，必需氨基酸缺乏，最終導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)氨的含量過(guò)量而中毒，隨之葉綠素解體，植物死亡[11]。草銨膦的傳導(dǎo)性較差，但草銨膦既可以在植物體內(nèi)隨蒸騰流在木質(zhì)部?jī)?nèi)向上運(yùn)輸，也可以在韌皮部?jī)?nèi)向地下部分運(yùn)輸[12]。該研究用不同濃度的草銨膦處理萌發(fā)期的油菜種子，發(fā)現(xiàn)草銨膦對(duì)萌發(fā)期油菜下胚軸和初生根都有抑制作用，且地上部分下胚軸對(duì)草銨膦更敏感。通過(guò)對(duì)不同濃度草銨膦處理的根尖分生區(qū)細(xì)胞進(jìn)行壓片觀察還發(fā)現(xiàn)，除草劑草銨膦能抑制油菜根尖細(xì)胞的有絲分裂，推斷可能是由于草銨膦抑制了細(xì)胞分裂過(guò)程中一些芳香氨基酸的合成，進(jìn)而使細(xì)胞分裂過(guò)程中某些蛋白質(zhì)的合成受阻，如抑制G2期DNA的合成[13]，從而抑制了細(xì)胞分裂，進(jìn)而抑制了油菜幼苗的生長(zhǎng)發(fā)育。也有研究表明，除草劑抑制細(xì)胞分裂與微管蛋白的合成有關(guān)[14]。此外，在壓片觀察時(shí)還發(fā)現(xiàn)了異常分裂的細(xì)胞，如落后染色體、染色體橋、多級(jí)分裂、微核等。細(xì)胞經(jīng)輻射或化學(xué)藥物的作用易導(dǎo)致分裂過(guò)程滯留染色體形成落后染色體、染色體橋、染色體斷片、環(huán)狀染色體等染色體畸變。由于末端黏連而出現(xiàn)雙著絲粒染色體，在其以后分離時(shí)就形成了染色體橋。除草劑還可能破壞了紡錘絲的正常結(jié)構(gòu)和功能[15]，使個(gè)別染色體分離滯后或出現(xiàn)多極分裂現(xiàn)象。微核的形成存在多種學(xué)說(shuō)[16]，而草銨膦最傾向于化學(xué)誘變學(xué)說(shuō)，當(dāng)細(xì)胞受到草銨膦作用后造成紡錘絲損傷或染色體斷片，在細(xì)胞分裂后期，這些斷片或落后的染色體不能進(jìn)入細(xì)胞核而凝聚形成微核游離在細(xì)胞質(zhì)中。除草劑影響細(xì)胞遺傳毒性的分子機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

該研究發(fā)現(xiàn)，即使百萬(wàn)分之一的草銨膦也會(huì)對(duì)油菜幼苗生長(zhǎng)產(chǎn)生明顯抑制作用，雖然草銨膦在土壤中易通過(guò)各種形式降解[4]，但若有微量草銨膦飄逸到附近農(nóng)作物、果樹(shù)、蔬菜[17-18]等綠色植物上，也會(huì)給生產(chǎn)者帶來(lái)較大損失，甚至危害農(nóng)田生態(tài)。

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