香龍血樹組織培養(yǎng)研究

漆麗萍 馬劍 李劍美 李援龍 強繼業(yè)

摘要 [目的]通過香龍血樹組織培養(yǎng)技術(shù)研究，建立香龍血樹再生繁殖體系。[方法]以莖段作為外植體，探索最適滅菌時間以及誘導(dǎo)培養(yǎng)基及增殖培養(yǎng)基最適6-BA和NAA的濃度組合。[結(jié)果]滅菌最適宜時間9 min;以MS作為基本培養(yǎng)基，誘導(dǎo)培養(yǎng)最適的6-BA和NAA濃度組合：2.0 mg/L 6-BA+0.20 mg/L NAA易誘導(dǎo)長出叢芽，5.0 mg/L 6-BA+0.20 mg/L NAA和5.0 mg/L 6-BA+0.50 mg/L NAA易誘導(dǎo)形成愈傷組織;以MS作為基本培養(yǎng)基，增殖培養(yǎng)最適6-BA和NAA濃度組合：3.0 mg/L 6-BA+0.10 mg/L NAA。[結(jié)論]利用帶腋芽莖段作為組織培養(yǎng)的外植體可迅速建立香龍血樹離體快繁體系。

關(guān)鍵詞 組織培養(yǎng);香龍血樹;帶腋芽莖段;快速繁殖

中圖分類號 Q943.1文獻標(biāo)識碼 A文章編號 0517-6611（2018）34-0071-04

龍血樹（Dracaena cambodian）屬于百合科龍血樹屬，樹葉為線狀披針形，簇生于枝條頂端，樹形極具特點，可塑性強，可以根據(jù)人的意愿塑造出不同形狀，樹干古樸滄桑，同時還能在頂部萌發(fā)新枝，給人一種沉穩(wěn)而不失朝氣的感覺，且十分耐陰，可在室內(nèi)盆栽多年仍然綠意盎然，是園林綠化及家庭盆栽的名貴樹種，具有很好的觀賞價值。同時藥用價值極高，具有止血、生肌、行氣等功效。

香龍血樹（Dracaena fragrans）是百合科龍血樹屬植物，別名也門鐵、大龍血樹、香千年木、巴西木、巴西鐵樹、山德氏龍血樹[1-4]。香龍血樹莖干挺拔，株形整齊，是重要的室內(nèi)觀葉樹種; 其小花具有濃烈的香氣，因此是良好的香味樹種;它喜光照充足、高溫、高濕環(huán)境，耐陰、耐干燥，多生長于熱帶或亞熱帶地區(qū)[5]。也門鐵具有綠葉也門鐵品種，后來又相繼出現(xiàn)了金心也門鐵、金斑也門鐵和金邊也門鐵新品種，成為近年來異軍突起的時尚觀葉植物新寵[6]。香龍血樹為單莖直立灌木，葉叢生于莖頂，無柄葉長寬線形，葉緣具波紋，呈深綠色，常見品種包括金邊香龍血樹（cv.Victoriae），葉緣深黃色帶白邊;金心香龍血樹（中斑香龍血樹）（cv.Massangeana），葉面中央具黃色縱條斑;黃邊香龍血樹（cv.Linderi），葉緣淡黃色;銀邊香龍血樹 （cv.Lindeniana） ，葉片邊緣乳白色[4，7]。這些品種與上文提到的也門鐵新品種是相同變種。

2007年春，廣東大規(guī)模推廣種植的也門鐵呈現(xiàn)爆發(fā)式開花，開花率為80%～90%，而按照以往種植經(jīng)驗也門鐵是很少開花，尤其是種植3年以下的幼株鮮有開花，由于花后死亡的傳言讓漂亮成品滯留花場，但也門鐵爆發(fā)式開花涉及內(nèi)因和外因，原因尚待考證[8]。實際上香龍血樹需經(jīng)過多年才能進入開花期，香龍血樹室內(nèi)栽培很少開花，觀察發(fā)現(xiàn)，香龍血樹在北方室內(nèi)栽培13年才首次開花，香味濃烈，但開花后不能結(jié)果[5]。香龍血樹目前多采用扦插法繁殖[ 7]。但由于香龍血樹為直立單莖灌木，分枝極少，扦插繁殖不能滿足大規(guī)模種苗需求，而組織培養(yǎng)途徑可以有效地解決市場種苗短缺的問題[2]。目前關(guān)于香龍血樹組織培養(yǎng)方面的研究報道較多，組織培養(yǎng)多采用MS作為基本培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中添加的植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)有6-BA、IAA、IBA、KT、NAA等，通常以頂芽、嫩莖段、腋芽、葉片作為外植體進行接種，都取得了較好的結(jié)果[2，9-13]。筆者對香龍血樹品種的組織培養(yǎng)技術(shù)進行研究，以期建立龍血樹品種快速繁殖體系，為滿足園林綠化苗木和市場對藥用資源的需求并進行規(guī)?；a(chǎn)提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料 香龍血樹頂芽和帶腋芽莖段取自于喜慶園林責(zé)任有限公司，取材時間是正午。

1.2 方法

1.2.1 外植體預(yù)處理。采集外植體前應(yīng)對母株或器官的生長環(huán)境進行評估（有害微生物的滋生程度），這是滅菌的重要依據(jù)。為了減少在組織培養(yǎng)中的褐化，可以對材料進行避光保濕（用濕潤的毛巾包裹，裝到避光處理的容器中），然后對外植體進行修整，切除枝條上的葉片及附屬物，用軟毛刷在流水下進行刷洗，清洗好以后，用毛巾把水吸干，然后將外植體剪成帶2～3個節(jié)的莖段，最后再用流水沖洗。龍血樹屬于木本植物，容易褐化，所以材料需要在流水下沖洗12 h，才能徹底沖洗凈外植體表面所附帶的泥土、蟲卵、病菌孢子。

1.2.2 外植體滅菌。對預(yù)處理的外植體用75%乙醇擦拭，然后拿到超凈工作臺上用紫外燈消毒30 min，接著用0.1%升汞消毒處理5～10 min，每種處理用20個外植體。將外植體接種于MS培養(yǎng)基中，45 d后統(tǒng)計外植體的污染率、存活率，篩選龍血樹外植體最佳消毒時間。污染率指污染芽數(shù)占總接種芽數(shù)的比例;死亡率指未污染芽中死亡芽數(shù)占總接種芽數(shù)的比例;存活率指未污染芽中存活芽數(shù)占總接種芽數(shù)的比例。

1.2.3 香龍血樹誘導(dǎo)培養(yǎng)。以帶腋芽莖段為外植體接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方：MS+30 g/L蔗糖+6 g/L瓊脂+0.3 g/L活性炭+6-BA+NAA，6-BA設(shè)置2.0、5.0 mg/L 2個濃度，NAA設(shè)置0.20、0.50、1.00 mg/L 3個濃度。6種誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方見表 每個培養(yǎng)基處理接種20個外植體。

1.2.4 香龍血樹增殖培養(yǎng)。以誘導(dǎo)培養(yǎng)獲得的不定芽為外植體接種到增殖培養(yǎng)基上，增殖培養(yǎng)基配方：MS+30 g/L蔗糖+6 g/L瓊脂+0.3 g/L活性炭+6-BA+NAA，6-BA設(shè)置2.0、3.0 mg/L 2個濃度，NAA設(shè)置0.05、0.10、0.50 mg/L 3個濃度。6種增殖培養(yǎng)基配方見表 每個培養(yǎng)基處理接種10個外植體。

1.3 誘導(dǎo)培養(yǎng)和增殖培養(yǎng)條件 溫度（25±2）℃，光照時間12～14 h/d，光照強度1 500～3 000 lx，光質(zhì)為T4燈管發(fā)出的光。

1.4 統(tǒng)計公式 各處理均在培養(yǎng)45 d后統(tǒng)計結(jié)果，記錄誘導(dǎo)率、出芽情況、芽增殖倍數(shù)及生長狀況。誘導(dǎo)率=[形成愈傷組織的莖段數(shù)/（接種總的莖段數(shù)-污染數(shù)）]×100%;芽增殖倍數(shù)=（增殖后芽總數(shù)/增殖前芽個數(shù)）×100%。

1.5 統(tǒng)計分析? 數(shù)據(jù)采用Excel 2010進行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 外植體最佳滅菌時間篩選 由表3可知，滅菌9 min效果最好，滅菌存活率最高，死亡數(shù)相對較低，污染率較低。

2.2 外植體誘導(dǎo)培養(yǎng)

由表4可知，外植體在接種45 d后，1～6號培養(yǎng)基都有愈傷組織形成（圖1），其中4號培養(yǎng)基誘導(dǎo)形成愈傷組織數(shù)量最多，誘導(dǎo)率為40%，其次為3號培養(yǎng)基，誘導(dǎo)率為35%。由此可見，MS+5.0 mg/L 6-BA+0.20 mg/L NAA和MS+5.0 mg/L 6-BA+0.50 mg/L NAA更易誘導(dǎo)形成愈傷組織，并具有分化能力;1～6號培養(yǎng)基都誘導(dǎo)長出芽（圖1），其中1號培養(yǎng)基（MS+2.0 mg/L 6-BA+0.20 mg/L NAA）更易誘導(dǎo)長芽。綜合看來初代培養(yǎng)中每種培養(yǎng)基都有較好的效果。

2.3 不定芽增殖培養(yǎng) 從表5可以看出，8號和11號培養(yǎng)基增殖倍數(shù)最高為2.0，8號培養(yǎng)基不定芽有2株長出根，生長良好（圖2），11號培養(yǎng)基不定芽長勢好，葉片綠;7號培養(yǎng)基增殖倍數(shù)為1.9，但不定芽生長緩慢，有一些開始變黃;9號和10號培養(yǎng)基增殖倍數(shù)為1.6，9號培養(yǎng)基不定芽長根同時帶有紅色分泌物附著在培養(yǎng)基表面，10號培養(yǎng)基不定芽長勢不明顯，有紅色分泌物附著在培養(yǎng)基表面（圖3）;12號培養(yǎng)基增殖倍數(shù)最低為1.5，但不定芽長勢好，葉片綠。綜合看來11號培養(yǎng)基增殖效果最好（圖4）。

3 結(jié)論與討論

組培香龍血樹用到的是長了2～3個月的枝條，選用的都是解剖刀能切割下來的帶腋芽莖段，外植體滅菌過程中要根據(jù)植物的生長環(huán)境以及生長時間來制定滅菌時間，需嚴(yán)格執(zhí)行，探索中發(fā)現(xiàn)用升汞滅菌9 min能達到滅菌效果，誘導(dǎo)過程中存活數(shù)最高，死亡數(shù)較少，這與黃莉雅等[14]研究結(jié)果一致。

香龍血樹接種在培養(yǎng)基MS+30 g/L蔗糖+6 g/L瓊脂+0.3 g/L活性炭+2.0 mg/L 6-BA+0.20 mg/L NAA上更容易誘導(dǎo)長出叢芽，在培養(yǎng)基MS +30 g/L蔗糖+6 g/L瓊脂+0.3 g/L活性炭+5.0 mg/L 6-BA+0.20 mg/L NAA和MS +30 g/L蔗糖+6 g/L瓊脂+0.3 g/L活性炭+5.0 mg/L 6-BA+0.50 mg/L NAA上更容易誘導(dǎo)形成愈傷組織，形成的愈傷組織經(jīng)誘導(dǎo)分化能長出生長健壯的苗。

血竭來源于自然界中生長10年以上的龍血樹，這種龍血樹受到刻傷、病害、蟲害，才會分泌一種紅色的液體附在傷口表面，在增殖培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)，有些培養(yǎng)基表面附有一些紅色分泌物，可能是血竭。楊本鵬等[15]在海南龍血樹組織培養(yǎng)過程中進行了不同生長調(diào)節(jié)劑及濃度對血竭形成誘導(dǎo)的研究，結(jié)果表明在含有GA3、 KT、 AD、 NAA、2，4-D和 IAA這 6 種生長調(diào)節(jié)劑的培養(yǎng)基上均不產(chǎn)生紅色，只有在含 6-BA的培養(yǎng)基上才能誘導(dǎo)龍血樹無菌組培苗產(chǎn)生血竭，且誘導(dǎo)血竭與6-BA濃度無關(guān)。該試驗中每種培養(yǎng)基均含有6-BA，但并不是所有培養(yǎng)基均能產(chǎn)生紅色分泌物，可能是由于除了6-BA外，培養(yǎng)基中還含有NAA;也可能是取材不同造成的。該研究中的香龍血樹形成“血竭”對生長調(diào)節(jié)劑和濃度要求與海南龍血樹不一樣。在組培過程中生產(chǎn)出血竭是非常有意義的，能有效地推動藥用植物在組培過程中的實踐與發(fā)展，但該試驗中紅色分泌物是否為血竭結(jié)果還有待證實。

繼代培養(yǎng)過程中2.0 mg/L 6-BA和0.10 mg/L NAA組合培養(yǎng)基上長出了根，對組培苗馴化，將其移栽到自然環(huán)境中，有1株和其他香龍血樹明顯不一樣，在葉片上出現(xiàn)了金邊（圖5a），而野生型植株葉色表現(xiàn)全綠（圖5b），可能是體細胞變異，使香龍血樹表現(xiàn)型出現(xiàn)了差異，雖然市場上已經(jīng)有金邊香龍血樹，但該研究中的金色葉緣變異和現(xiàn)有的金邊性狀還存在很大差異，可能是一種新的變異類型。這種變異產(chǎn)生的原因是否屬于可遺傳的變異，以及后代能否100%保持這種變異還有待進一步研究。

參考文獻

[1]劉志政，張廣楠.香龍血樹的扦插與栽培技術(shù)[J].青海農(nóng)林科技，2004（2）：59-60.

[2]劉頌頌，朱劍云，何業(yè)華，等.也門鐵工廠化育苗技術(shù)[J].經(jīng)濟林研究，2006，24（4）：71-73.

[3]劉和平，何業(yè)華，林劍波，等.也門鐵及其嵌合體葉綠素合成特性研究[J].北方園藝，2011（14）：120-122.

[4]杜文成.香龍血樹[J].花木盆景（花卉園藝），2004（11）：30-31.

[5]李錦，李彥明.北方室內(nèi)盆栽香龍血樹[J].中國花卉園藝，2007（18）：40-41.

[6]胡一民.時尚觀葉新寵——也門鐵[J].中國花卉盆景，2007（1）：8-9.

[7]盧思聰.香龍血樹及其常見同屬植物[J].中國花卉盆景，1998（1）：4-6.

[8]鐘志權(quán).關(guān)于也門鐵爆發(fā)式開花[J].花木盆景（花卉園藝），2007（8）：28.

[9]陳興華，何旭君，張華通，等.也門鐵組培工廠化育苗技術(shù)路線[J].仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院學(xué)報，2010，23（2）：21-24.

[10]陳麗文，楊利平，榮薏，等.金心也門鐵工廠化育苗技術(shù)研究[J].北方園藝，2013（13）：138-141.

[11]何業(yè)華，劉和平，劉頌頌，等.也門鐵嵌合體品種在離體培養(yǎng)中的變異規(guī)律及調(diào)控[J].華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2008，29（2）：70-73.

[12]侯占銘，滿都拉.香龍血樹和紫鐵的組織培養(yǎng)與快速繁殖[J].內(nèi)蒙古大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），200 32（6）：642-643.

[13]易清，何業(yè)華，劉頌頌，等.3個也門鐵品種高效離體繁殖體系的建立[J].湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2007，33（4）：440-446.

[14]黃莉雅，陳國臣，馬錦林.劍葉龍血樹芽外植體誘導(dǎo)分化[J].廣西林業(yè)科學(xué)，2010，39（3）：144-146.

[15]楊本鵬，張樹珍，蔡文偉，等.海南龍血樹組織培養(yǎng)過程中血竭形成的誘導(dǎo)[J].熱帶作物學(xué)報，2009，30（2）：181-185.