46份粳稻品種抗稻瘟病基因的分子檢測及抗性評(píng)價(jià)研究

陳培峰 喬中英 謝裕林 董明輝 伍應(yīng)保 朱勇良 宋云生

摘要 [目的]對(duì)46份粳稻品種抗稻瘟病基因進(jìn)行分子檢測，并對(duì)其進(jìn)行抗性評(píng)價(jià)。[方法]利用水稻稻瘟病抗病基因Pi-ta、Pi-b、Pi54和Pi21的功能標(biāo)記對(duì) 46份育種材料進(jìn)行分子標(biāo)記檢測，結(jié)合稻瘟病抗性接種鑒定，對(duì)基因型與表型進(jìn)行相關(guān)性分析。[結(jié)果]46 個(gè)品種中攜帶Pi-ta、Pi-b、Pi54和Pi21抗性基因的材料分別為 18、35、22和16個(gè)，其中3個(gè)材料含有4個(gè)抗性基因;6個(gè)材料含有 3個(gè)抗性基因;25個(gè)材料含有 2個(gè)抗性基因;11個(gè)材料含有 1個(gè)抗性基因;1個(gè)未檢測到抗性基因。結(jié)合稻瘟病田間抗性鑒定表明，同時(shí)含有3個(gè)以上抗性基因的材料只有2份表現(xiàn)為中感（MS）和感?。⊿），其他均為中抗（MR）以上。[結(jié)論]單一抗病基因型的抗病能力因新生理小種的出現(xiàn)而不穩(wěn)定，抗病基因的聚合利用和新的廣譜抗性基因的發(fā)掘迫在眉睫。

關(guān)鍵詞 水稻;抗稻瘟病基因;分子標(biāo)記檢測;抗性評(píng)價(jià)

中圖分類號(hào) S511文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A文章編號(hào) 0517-6611（2018）34-0065-03

稻瘟病是水稻重要病害之一，具有傳播速度快、發(fā)生范圍廣、暴發(fā)頻率高、危害嚴(yán)重等特點(diǎn)，在我國常年均有不同程度的發(fā)生，造成的產(chǎn)量損失可達(dá)40%～50%，局部田塊甚至顆粒無收[1]。挖掘有效的抗病基因，通過生物技術(shù)將抗病基因?qū)胨酒贩N內(nèi)快速培育出抗病水稻品種是解決水稻稻瘟病危害的重要途徑[2-5]。隨著分子標(biāo)記技術(shù)的普遍應(yīng)用，大量新的抗稻瘟病基因被定位在不同的染色體上。到目前為止，有50多個(gè)抗瘟基因（或QTLs）被定位。除了第3號(hào)染色體沒有發(fā)現(xiàn)抗稻瘟病基因外，其他染色體上都含有1～3個(gè)抗性基因位點(diǎn)。許多抗稻瘟病基因被定位在第6、11和12號(hào)染色體上[6-8]，抗性基因分子標(biāo)記的設(shè)計(jì)研發(fā)為抗性基因在水稻抗病育種中的開發(fā)利用提供了有效手段。但稻瘟病菌容易發(fā)生變異，同一水稻產(chǎn)區(qū)稻瘟菌的種群結(jié)構(gòu)及生理小種經(jīng)常發(fā)生變化，導(dǎo)致抗病品種在種植數(shù)年后，抗性水平下降甚至喪失[9-10]。通過發(fā)掘、鑒定抗稻瘟病基因資源，鑒定抗病基因，對(duì)于有效、合理地利用抗病基因資源，利用分子標(biāo)記輔助選擇培育持久抗稻瘟病品種有重要意義。筆者以江蘇省主要利用的4個(gè)抗病基因Pi-ta、Pi-b、Pi54和Pi21的分子標(biāo)記對(duì)46份育種材料進(jìn)行基因檢測，并對(duì)材料進(jìn)行穗頸瘟人工接種鑒定，通過材料的抗病表現(xiàn)綜合評(píng)價(jià)抗病基因在育種中的利用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試品種 46 份，為蘇州市農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻育種的中間穩(wěn)定材料。

1.2 稻瘟病抗性田間鑒定方法

采用田間誘發(fā)的方式，用蘇御糯作為感病對(duì)照品種。5月12日育秧，地寬100 cm，插秧前劃行、插牌。每個(gè)品種南北方向，5行10穴插秧。在參試品種兩側(cè)插種感病誘發(fā)品種蘇御糯，間隔插秧。在水稻分蘗初期，田間撒播上年收集的稻瘟病菌標(biāo)樣，有利于發(fā)病，在水稻基本黃熟后調(diào)查水稻穗頸瘟。按國家統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，檢查發(fā)病情況，分級(jí)記載。

1.3 稻瘟病抗性基因的分子標(biāo)記

利用Pi-ta、Pi-b、Pi54和Pi21抗性基因引物檢測材料，引物名稱、序列及其擴(kuò)增片段預(yù)期大小見表 1。

1.4 稻瘟病抗性基因檢測

采用 SDS 法提取水稻基因組 DNA。以基因組DNA 為模板進(jìn)行基因片段擴(kuò)增，PCR 反應(yīng)體系參照范方軍等[11]的方法。反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng) 1%的瓊脂糖凝膠電泳分離，溴化乙錠染色，在紫外凝膠成像儀上觀察并照相。

2 結(jié)果與分析

2.1 稻瘟病田間抗性鑒定結(jié)果

由表2可知，在46 份品種中，蘇2473表現(xiàn)為抗?。≧）;蘇4081、蘇4088、蘇5069、蘇5234等 11個(gè)材料表現(xiàn)為中抗（MR）;蘇2479、蘇2483、蘇5073、蘇5079等21個(gè)材料表現(xiàn)為中感（MS）;蘇2766、蘇5126、蘇5127、蘇5283、蘇5286等 13 個(gè)品種表現(xiàn)為感?。⊿）;未有材料表現(xiàn)為高感（HS）。

2.2 稻瘟病抗性基因檢測結(jié)果

利用水稻稻瘟病基因Pi-ta、Pi-b、Pi54和Pi21的功能標(biāo)記檢測46份育種材料，結(jié)果表明（表2），蘇2473、蘇5069、蘇5073、蘇5079等18個(gè)材料含有抗稻瘟病基因 Pi-ta，占比為39.13%;蘇2473、蘇2479、蘇2483、蘇2766等35個(gè)材料含有抗稻瘟病基因 Pi-b，占比為76.09%;蘇2473、蘇2479、蘇2483、蘇4081 等22 個(gè)材料含有抗稻瘟病基因 Pi54，占比為47.83%;蘇2473、蘇5114、蘇5234、蘇5245等 16 個(gè)材料含有抗稻瘟病基因 Pi2 占比為34.78%。蘇2473、蘇6000、蘇6002 這3個(gè)材料含有4個(gè)抗性基因，蘇5069、蘇5114、蘇5234、蘇5878等 6 個(gè)材料含有 3 個(gè)抗性基因;蘇2479、蘇2483、蘇2766、蘇4081等 25個(gè)材料含有 2 個(gè)抗性基因;蘇5126、蘇5127、蘇5281、蘇5348等11個(gè)材料含有 1 個(gè)抗性基因;蘇5290未檢測到抗性基因。

結(jié)果還表明（表3），未檢測到抗性基因的1個(gè)材料表現(xiàn)為感?。⊿）;檢測到1個(gè)抗性基因的材料中有7個(gè)材料表現(xiàn)為中感（MS），4個(gè)材料表現(xiàn)為感?。⊿）;檢測到2個(gè)抗性基因的材料中有5個(gè)材料表現(xiàn)為中抗（MR），13個(gè)材料表現(xiàn)為中感（MS），7個(gè)材料表現(xiàn)為感?。⊿）;檢測到3個(gè)抗性基因的材料中有4個(gè)材料表現(xiàn)為中抗（MR），1個(gè)材料表現(xiàn)為中感（MS），1個(gè)材料表現(xiàn)為感病（S）;檢測到4個(gè)抗性基因有1個(gè)材料表現(xiàn)為抗?。≧），2個(gè)材料表現(xiàn)為中抗（MR）。

3 結(jié)論與討論

培育和利用抗病品種是目前防治稻瘟病最經(jīng)濟(jì)有效的措施，然而由于稻瘟病菌的致病性分化嚴(yán)重，生理小種多，變異頻繁，給抗病品種的選育帶來了困難，因此發(fā)掘、鑒定和利用抗病資源，并通過分子標(biāo)記定位抗病基因，并通過標(biāo)記輔助選擇提高抗病品種的選擇效率，對(duì)指導(dǎo)培育更優(yōu)良的抗稻瘟病新品種具有重要的理論和實(shí)踐意義。Pi-ta 、Pi-b、Pi54和 Pi21是水稻育種中重要的抗稻瘟病基因，研究表明抗稻瘟病基因Pi-ta 和Pi-b與穗頸瘟抗性存在顯著相關(guān)性[11-12]。有研究發(fā)現(xiàn)Pi-ta、Pi-b、Pi54、Pikm在山東及黃淮區(qū)新選育品種中分布頻率較高，其中 Pi-b、Pi54、Pikm的分布頻率超過或接近50%，且Pikm與稻瘟病抗性存在顯著相關(guān)[13]。該研究表明，Pi-b在供試材料中分布頻率較高，達(dá)76.09%，大多數(shù)材料均含有Pi-b基因，Pi-ta和Pi21的分布頻率僅有35%左右。結(jié)合稻瘟病田間抗性鑒定表明，同時(shí)含有3個(gè)以上抗性基因的材料只有2份表現(xiàn)為中感（MS）和感?。⊿），其他均為中抗（MR）以上，而只含其中1個(gè)抗性基因材料中未出現(xiàn)中抗以上的材料。由于抗病品種的單一化以及稻瘟病菌的復(fù)雜性和易變性，單一優(yōu)勢抗性基因的利用極易使得稻瘟病菌群體中的毒性小種演變成為優(yōu)勢小種而造成水稻稻瘟病抗性喪失，因此，抗病基因的聚合利用和新的廣譜抗性基因的發(fā)掘是今后水稻抗稻瘟病育種工作的重點(diǎn)。

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