物理誘變在藥食用菌育種中的應(yīng)用研究進展

孫玲　劉利平　徐婉茹　李哲　孫宇　張志才　馬海樂

摘要 藥食用真菌以其營養(yǎng)豐富、免疫調(diào)節(jié)、抗菌、抗癌等營養(yǎng)保健功能而深受人們喜愛，提高藥食用真菌產(chǎn)量、改善藥食用真菌品質(zhì)是食用菌育種的重要目標(biāo)，物理誘變育種發(fā)揮了重要作用。介紹了物理誘變法在藥食用真菌育種中的應(yīng)用進展，并對物理誘變機理、物理誘變過程進行了綜述。

關(guān)鍵詞 食用菌；物理誘變；菌種選育

中圖分類號 S646 文獻標(biāo)識碼

A 文章編號 0517-6611（2018）14-0029-05

Research Progress on Physical Mutation Breeding of Edible and Medical Fungi

SUN Ling， LIU Liping，XU Wanru et al

（School of Food and Biological Engineering，Jiangsu University，Zhenjiang，Jiangsu 212013）

Abstract It is very popular to eat edible and medical fungi which has nutrition and health care function，for example，immune regulation， antibacterial， anticancer and so on. How to improve yield and quality is the important goal of edible and medical fungi breeding. Physical mutation plays important roles in edible and medical fungi breeding. The recent progress of

different physical mutation methods in study of edible and medical fungi physical mutation were introduced.The possible mechanism of inducing mutation and the main inducing process were reviewed.

Key words Edible and medical fungi；Physical mutation；Breeding

藥食用真菌是可食用和藥用的大型真菌，我國是世界上認(rèn)識、利用藥食用真菌最早的國家之一，也是栽培藥食用真菌歷史最長的國家。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，藥食用真菌中具有的生藥學(xué)活性成分逐漸受到人們重視，“一葷一素一菌菇”的飲食習(xí)慣開始深入人心。據(jù)中國食用菌協(xié)會統(tǒng)計[1]，1978年我國食用菌產(chǎn)量僅6萬t，占全球的5.7%，到2013年食用菌產(chǎn)量已高達3 167萬t。由于菌菇類價格較高、較種植一般農(nóng)作物收益高，因此栽培藥食用真菌有利于提高國民生產(chǎn)收入，尤其是提高農(nóng)民收入。我國野生藥食用真菌資源豐富，但可栽培的藥食用真菌種類偏少、品種較單一，很大程度上限制了藥食用真菌的發(fā)展規(guī)模，藥食用真菌菌種選育已成為亟需解決的問題。目前人工栽培的藥食用真菌品種大多是通過馴化野生菌種、雜交育種、誘變育種等方法培育獲得。盡管藥食用真菌在自然條件下也會發(fā)生突變，但突變率極低，有益于產(chǎn)量提高、品質(zhì)提升的突變株更少，而人工育種能夠加速提高藥食用真菌的優(yōu)良菌株的選育。隨著生物技術(shù)的快速發(fā)展，基因工程、蛋白質(zhì)點突變技術(shù)等技術(shù)在微生物育種工作中發(fā)揮了極大的作用。由于藥食用真菌種類繁多，相關(guān)基礎(chǔ)研究較少，金針菇、香菇、杏鮑菇、牛樟芝、灰樹花、靈芝等藥食用真菌的全基因組測序也是近幾年才完成[2-5]，因此，采用基因工程等技術(shù)對藥食用真菌育種尚存在很大難度。傳統(tǒng)的誘變育種具有簡單、易行、高效，且對基因組信息要求較低等優(yōu)點，在藥食用真菌的菌種選育中發(fā)揮了重要作用。誘變育種方法包括物理誘變、化學(xué)誘變、生物誘變等，物理誘變具有安全、高效等優(yōu)點因而深受廣大育種工作者喜愛，筆者綜述了物理誘變技術(shù)在藥食用真菌菌種選育中的研究進展，總結(jié)了物理誘變原理、物理誘變菌種選育過程以及相關(guān)注意問題，以便于藥食用真菌優(yōu)良菌株的篩選和生產(chǎn)應(yīng)用。

1 物理誘變

1.1 物理誘變方法

物理誘變的原理是使用各種射線對藥食用真菌進行誘變處理， 從中篩選具有優(yōu)良性狀的單菌株，傳統(tǒng)誘變主要采用紫外線、X 射線、γ射線、快中子等方法進行誘變。隨著科技的發(fā)展，最新物理誘變技術(shù)相繼出現(xiàn)，激光、超聲波、電磁波、微波、宇宙射線等誘變方法，極大地促進了藥食用真菌的菌種選育。

1.1.1 傳統(tǒng)物理誘變方法。

傳統(tǒng)物理誘變一直在農(nóng)作物、微生物等育種工作中發(fā)揮著重要作用，由于大多藥食用真菌遺傳背景、分子生物學(xué)等信息尚不清楚，傳統(tǒng)物理誘變育種在藥食用真菌優(yōu)良菌種選育中仍具有重要價值。

1.1.1.1 紫外線誘變。紫外線誘變是使用最早、沿用最久、應(yīng)用廣泛的物理誘變技術(shù)。因紫外誘變設(shè)備易得、操作簡單，一直是農(nóng)作物、果蔬、微生物等育種中使用最多的誘變方法，該技術(shù)使很多優(yōu)良品種得以應(yīng)用推廣。紫外誘變育種的特點：在260 nm紫外區(qū)域范圍內(nèi)DNA吸收峰最高，易形成嘧啶二聚體，阻礙堿基正常配對和DNA雙鏈的解旋，影響DNA鏈的復(fù)制，導(dǎo)致誘變材料發(fā)生突變甚至死亡。紫外線這一特點使得紫外誘變一直深受廣大育種工作者的喜愛，在藥食用真菌的誘變育種方面起到極大促進作用。

1.1.1.2 電離輻射誘變。X射線和γ射線都是高能電磁波，利用放射源照射植物材料，放射源放射出的快速運動的帶電粒子通過物質(zhì)時，與物質(zhì)原子中的電子和原子核相互發(fā)生碰撞，進行能量轉(zhuǎn)換，使物質(zhì)內(nèi)部發(fā)生電離或激發(fā)，形成正離子和負(fù)離子或激發(fā)態(tài)原子。輻射產(chǎn)生的電離作用以直接或間接的方式作用于DNA結(jié)構(gòu)，直接作用是引起堿基、脫氧核糖、糖-磷酸等化學(xué)鍵斷裂，間接作用是通過電離輻射使水、有機分子等產(chǎn)生的自由基間接作用于DNA分子，從而引起基因突變、染色體斷裂等。X射線和γ射線含有比紫外線更多的能量和穿透力，更易打斷DNA雙鏈或單鏈，引起染色體斷裂、缺失、重復(fù)、插入等突變。X射線、γ射線等傳統(tǒng)輻射技術(shù)在水稻、小麥、大豆等農(nóng)作物育種中起主力軍作用，以60Co-γ、X射線誘變育種應(yīng)用最廣，已經(jīng)培育出大量新品種。由于這些射線誘變具有突變效率高、誘變簡易的優(yōu)點，因而也應(yīng)用于藥食用真菌菌種的選育。

1.1.2 最新物理誘變方法。

物理誘變技術(shù)的發(fā)展有利于克服傳統(tǒng)誘變技術(shù)的局限性、拓寬誘變域、提高誘變效率，以下是近些年發(fā)展的物理誘變方法，有望在藥食用真菌優(yōu)良菌種選育中發(fā)揮重要作用。

1.1.2.1 激光誘變。 20世紀(jì)60年代才逐步興起的激光誘變技術(shù)已成 為農(nóng)作物品種選育的主力軍，其被廣泛用于微生物、藥食用真菌等菌種選育。激光具有能量集中、方向性好、定向性強等特點，根據(jù)激發(fā)器激發(fā)波長不同，分為紫外激光（波長260～380 nm）、可見光激光（波長440～700 nm）、紅外激光（波長900～447.2×103nm），大多數(shù)頻率的激光都有誘變效果，最常用的激光器主要是CO2、He-Ne、N2、YAG等。

1.1.2.2 超聲波誘變。超聲波是一種頻率高于20 kHz的聲波，具有方向性好、穿透能力強、聲能集中、在水中傳播距離遠(yuǎn)等特點，已在醫(yī)學(xué)、軍事、工業(yè)、農(nóng)業(yè)上有很多的應(yīng)用。超聲波在誘變育種方面也有重要應(yīng)用價值，主要作用體現(xiàn)在：①機械作用，如果超聲誘變的頻率與DNA分子的固有頻率相同，就能發(fā)生共振，在共振狀態(tài)的DNA分子吸收超聲的能量達到峰值，會使原子發(fā)生劇烈振動，這種不穩(wěn)定性可能導(dǎo)致DNA分子斷裂，引起突變；②熱效應(yīng)，在超聲過程中會對生物體產(chǎn)生熱效應(yīng)，為生物體中的各種酶提供反應(yīng)條件，試驗證明超聲空化效應(yīng)使單泡在閉合瞬間可產(chǎn)生高達7 000～16 000 K的瞬息高溫，這瞬間的高溫是否也對DNA等遺傳物質(zhì)產(chǎn)生了誘變篩選作用，有待于試驗驗證；③氧化還原作用，超聲作用下能夠形成具有強氧化還原特性的H·和·OH自由基，這些自由基直接作用在DNA等生物大分子上引起突變[6]。

1.1.2.3 離子束誘變。離子束誘變技術(shù)是20世紀(jì)80年代新興技術(shù)，是指將一束具有能量的帶電粒子注入細(xì)胞內(nèi)，帶電粒子注入后由于能量作用、質(zhì)量沉積、動量傳遞、電荷交換等反應(yīng)引起各種復(fù)雜的生物效應(yīng)，引起DNA鏈斷裂、基因突變、重組等。離子束誘變具有損傷輕、突變率高、突變譜寬、遺傳穩(wěn)定、易于獲得理想菌株等特點，最早用于水稻、小麥等農(nóng)作物的誘變育種，并且誘變出多個具有優(yōu)良性狀的新品種。離子束誘變在藥食用真菌的菌種選育中也發(fā)揮了重要作用。

1.1.2.4 微波誘變。微波是指頻率為300 MHz～300 GHz的電磁波，是一種低能電磁輻射，微波處理后生物體產(chǎn)生熱效應(yīng)和非熱效應(yīng)，熱效應(yīng)是指能夠引起生物體局部溫度上升，引起一系列生理生化反應(yīng)，甚至死亡；非熱效應(yīng)是指生物體在低強度的微波作用下不產(chǎn)生明顯的溫度升高，但已經(jīng)引起生物體內(nèi)生理生化功能發(fā)生變化。經(jīng)過多年研究，微波育種在農(nóng)作物、蔬菜、工業(yè)微生物等領(lǐng)域取得了一些成果。

1.1.2.5 脈沖強光誘變。脈沖強光具有誘變育種的作用。脈沖強光可致死微生物，關(guān)于脈沖強光殺菌效果和機制的研究較多，由于脈沖強光對微生物的核酸結(jié)構(gòu)有影響，因此其可誘變微生物產(chǎn)生突變。張佰清等[7]利用脈沖強光誘變啤酒酵母，脈沖處理電壓分別選擇1 000、1 500、2 000、2 500、3 000 V，分別選擇閃照次數(shù)為4、8、16、32、48，篩選出的10#和12#這2株菌株發(fā)酵性能較好，且未對啤酒酵母的發(fā)酵度產(chǎn)生負(fù)面效應(yīng)。孟憲軍等[8]采用電脈沖強光對納塔爾鏈霉菌（Streptomyces natalensis）進行誘變處理，選育出1株遺傳性狀穩(wěn)定的正突變株SN114，納他霉素產(chǎn)量達1.098 g/L，較出發(fā)菌株提高1.6倍。趙春燕等[9]采用脈沖強光照射誘變技術(shù)、定向分離篩選Nisin高產(chǎn)菌株，發(fā)現(xiàn)脈沖電壓為1 000 V 的誘變效果優(yōu)于1 500 V，低劑量脈沖強光誘變效果比高劑量更好，選育到1株Nisin高產(chǎn)菌株，以上說明脈沖強光具有誘變作用，有望用于其他菌種選育。

1.1.2.6 超臨界CO2誘變。超臨界CO2是一種環(huán)境友好的溶劑，對微生物具有一定的致死效應(yīng)，同樣也具有誘變的潛力。張巧艷等[10]嘗試用超臨界CO2對脂肪酶（Flavobacterium sp. Strain YY25）菌株進行誘變處理。研究CO2壓力、溫度、處理時間以及化學(xué)添加劑（二甲亞砜、水合肼）對YY25菌株存活率和正突變率的影響，確定的最適誘變劑量分別為8 MPa、35 ℃、30 min的超臨界CO2和1%的二甲亞砜、0.5%的水合肼。經(jīng)過誘變篩選獲得1株產(chǎn)酶活力為29.0 U/mL的突變株（YY25-H0.5），較出發(fā)菌株YY25提高76.7%，有望用于誘變育種。

1.1.2.7 復(fù)合誘變。不同誘變法都有其自身突變域的局限性，單一誘變方法往往難以達到預(yù)期效果，采用2種及其以上的誘變方法，即復(fù)合誘變法，有利于拓展突變譜、增加突變頻率、提高正突變率。復(fù)合誘變既可以使用2種物理誘變法，也可以是物理誘變法與化學(xué)誘變、生物誘變、雜交育種、基因組重排等方法配合使用。復(fù)合誘變方法主要有2種：① 2種誘變方法依次處理出發(fā)菌株，即第1種誘變處理后緊接第2種誘變處理，篩選優(yōu)良菌株；②每次誘變處理都篩選菌種1次，即第1種誘變處理后篩選優(yōu)良菌株，然后對選育出的優(yōu)良菌株進行第2種誘變處理，再次篩選優(yōu)良菌株。復(fù)合誘變法較單一誘變法的優(yōu)勢已在藥食用真菌菌種選育工作中得到證實。采用復(fù)合誘變法有利于克服各種突變方法的局限性，拓寬突變域，更有利于篩選到有益菌株。

1.2 物理誘變育種機理 誘變育種是使遺傳物質(zhì)發(fā)生改變的過程，只有遺傳物質(zhì)改變才能獲得能夠遺傳的突變株。細(xì)胞基因組DNA發(fā)生損傷，如果沒有及時被修復(fù)，將在復(fù)制、轉(zhuǎn)錄過程中出錯，易產(chǎn)生突變、基因組變異甚至死亡。深入研究誘變機理有利于提高誘變效率、加快誘變育種。根據(jù)最新研究進展綜述了目前研究較多的物理誘變機理。

1.2.1 紫外誘變育種。

紫外誘變育種是廣泛應(yīng)用的育種方法，研究紫外線對DNA損傷的機理有利于提高紫外誘變效率。由于自然光中的紫外線對人、農(nóng)作物等均造成一定程度的傷害，很多研究集中在DNA的損傷修復(fù)機制。紫外誘導(dǎo)DNA中相鄰的嘧啶交聯(lián)形成嘧啶二聚體，包括環(huán)丁烷嘧啶二聚體（cyclobutane pyrimidine dimer，CPD）、嘧啶（6-4）嘧啶酮光產(chǎn)物和杜瓦價同分異構(gòu)體[11]。核苷酸切除修復(fù)（nucleotide excision repair ，NER）是去除紫外誘導(dǎo)的嘧啶二聚體的主要修復(fù)方式。DNA損傷后沒有及時修復(fù)影響其復(fù)制和轉(zhuǎn)錄，引起突變、染色體變異，甚至死亡。在哺乳動物中，環(huán)丁烷嘧啶二聚體主要位于核小體上的DNA中，專一由核苷酸切除修復(fù)通路修復(fù)。Horikoshi等[12]解析了含有環(huán)丁烷嘧啶二聚體的核小體晶體結(jié)構(gòu)。在核小體中，CPD只引起有限的骨架扭曲，受影響的堿基局限在雙鏈中，而且在核苷酸切除修復(fù)通路起始階段UV-DDB（UV-damaged DNA-binding protein，UV-DDB）也有效結(jié)合到核小體的CPD上，這些結(jié)果為了解CPD在染色質(zhì)中如何適應(yīng)和被識別提供了重要的結(jié)構(gòu)和生化信息。最新研究[13]表明，紫外線誘變后2 min內(nèi)被誘導(dǎo)的RNA m6A甲基化迅速聚集到DNA損傷位點，修復(fù)由紫外線照射DNA引起的CPD，迅速招募DNA聚合酶kappa到DNA斷點修復(fù)DNA，揭示了由紫外線引起的DNA損傷修復(fù)與RNA修復(fù)過程的聯(lián)系。

1.2.2 重離子束誘變育種。重離子束誘變是一種有效的誘變劑。重離子束具有高突變率、突變譜廣的特點，能有效誘導(dǎo)新突變體產(chǎn)生。在很難用γ或X射線誘導(dǎo)突變的菊花和康乃馨中，重離子束誘變有較好的誘變效果[14]。這可能是由于沿著離子質(zhì)點軌跡的一定區(qū)域內(nèi)含有濃密的離子。線性能量轉(zhuǎn)移（linear energy transfer， LET， keV/μm）代表了局部能量存儲的程度，是重離子突變的一個重要參數(shù)。在較低LET范圍內(nèi)，隨著LET參數(shù)提高誘變率提高。例如碳離子束的LET在30.0 keV/μm時較LET強度在22.5 keV/μm時具有2倍以上的誘變率，與常用化學(xué)誘變試劑乙基甲磺酸（ethyl methane sulfonate，EMS）的誘變率相似，誘變的突變體80%以上為堿基替換、100 bp以內(nèi)小片段DNA缺失、插入，少數(shù)涉及染色體的重排[15]。隨著重離子劑量的進一步提高，重離子束誘變的突變率將進一步降低，染色體重排概率提高。例如以640 keV/μm的高LET鐵離子誘變較低LET誘變有較低的突變率，突變有堿基缺失、大片度DNA缺失、大片段DNA重復(fù)、DNA重排等形式，表明重離子束誘變更有利于獲得染色體的重排和大片段的缺失等突變體[16]。利用微陣列比較基因組雜交技術(shù)（Array-CGH）和重測序技術(shù)在整個染色體水平上綜合分析氬離子或鐵離子對擬南芥基因組重排的影響，Array-CGH數(shù)據(jù)顯示氬離子或鐵離子誘變后基因組內(nèi)缺失片段平均數(shù)分別是1.9和3.7，而且81%的缺失與基因組的重排同時存在，分析發(fā)現(xiàn)DNA重排多數(shù)是染色體內(nèi)重排，少數(shù)存在染色體間重排，表明重離子束導(dǎo)致染色體內(nèi)聚集的DNA損傷，有利于育種和突變系的構(gòu)建[17]。

1.2.3 激光誘變育種。激光是一種高亮度的定向能束，是由原子或者分子受到激發(fā)而產(chǎn)生的被放大的一種相干光輻射，由于激光源應(yīng)用簡單、易行，且突變效果佳，已被廣泛應(yīng)用于育種。激光誘變過程涉及多光子的吸收和等離子的形成，激光產(chǎn)生的最大功率有利于在活細(xì)胞核內(nèi)沉積亞微米大小的輻射能，激活電離和光化學(xué)驅(qū)動過程。利用超快[<200 fs （200×10-15 s）]、能量低于100 pJ的激光處理，在多光子吸收過程中有可能產(chǎn)生DNA損傷，包括雙鏈斷裂、單鏈斷裂和單堿基損傷，損傷的機制涉及直接電離作用、核酸電子激發(fā)態(tài)的產(chǎn)生，或者在DNA附近產(chǎn)生其他活性中間體通過水或者其他細(xì)胞組分誘導(dǎo)DNA的非直接損傷[18]。He-Ne激光在激光誘變育種中發(fā)揮了重要作用，激光輻照劑量、輸出功率、輻照時間等是影響細(xì)胞存活率、正突變率的重要參數(shù)[19]。

2 物理誘變在藥食用真菌育種中的應(yīng)用

2.1 物理誘變在食用菌育種中的應(yīng)用

物理誘變技術(shù)的發(fā)展，尤其是最新物理誘變技術(shù)的開發(fā)和應(yīng)用，極大地促進了食用菌菌種選育。以幾種常見食用菌為例介紹物理誘變育種的應(yīng)用。

2.1.1 香菇。段東霞[20]采用波長為632.8 nm的He-Ne激光，以不同劑量輻照香菇135原生質(zhì)體，產(chǎn)生了不同效果的誘變效率，篩選到的變異株經(jīng)酯酶同工酶譜分析發(fā)現(xiàn)酶帶條紋數(shù)、遷移率等均發(fā)生了顯著變化，變異株的生長速率、生物量也發(fā)生了明顯變化。江枝和等[21]利用60Co-γ射線輻射大杯香菇，結(jié)果發(fā)現(xiàn)1.25 kGy處理組較其他處理組誘變效果好，為較適宜的輻射劑量。顏麗君等[22]采用 60Co-γ射線輻照誘變尖端菌絲，在輻照劑量800 Gy、劑量率8.3 Gy/min的條件下，通過菌絲生長速度、拮抗試驗、品比栽培選育出1株姬松茸優(yōu)良菌株JB6，新菌株在菌絲長速、出菇期及產(chǎn)量等方面，均優(yōu)于對照菌株。

2.1.2 草菇。草菇是典型的熱帶高溫型食用菌，菌絲對低溫的抵抗力差，對環(huán)境條件的變化尤其是對溫度的變化很敏感。與大多數(shù)食用菌相比，草菇存在著冷害，即在4 ℃的低溫條件下保存，菌絲會發(fā)生自溶而導(dǎo)致菌種死亡和子實體發(fā)軟，液化直至腐爛，這給草菇的菌種保存和產(chǎn)后保鮮帶來了極大的困難。Zhu等[23]先通過1%EMS、40 s紫外誘變、750 Gy 60Co-γ輻射等誘變方法處理不同種草菇的菌絲，篩選到16個突變株，以16個突變株為出發(fā)親本菌株，經(jīng)4輪基因組重排和低溫抗性檢測，篩選到3個菌株（VF1、VF2和VF3）在10 ℃條件下可分別保存20、28、28 h，較抗低溫效果較好的出發(fā)菌株提高25%、75%和75%；韓業(yè)君等[24]通過UV、60Co-γ射線、硫酸二乙酯（DES）對草菇V23原生質(zhì)體進行復(fù)合誘變，從近1 500株誘變菌株中選育出耐常規(guī)低溫（4 ℃）≥10 d菌株VH1、VH2、VH3、VH4。除VH1以外，各誘變株在較低溫度（18、22、26、28、30 ℃）下生長速度明顯高于CK。

初篩、復(fù)篩獲得耐常規(guī)低溫（4 ℃）10 d的菌株VH，在26 ℃下的生物學(xué)效率明顯優(yōu)于出發(fā)菌株，且差異極顯著、遺傳性狀穩(wěn)定，是具有潛在應(yīng)用價值的優(yōu)良菌株。

2.1.3 金針菇。成亞利等[25]用紫外線對金針菇（Flammulina velutipes）Y19和W088菌株原生質(zhì)體照射1 min進行誘變處理，篩選出的突變菌株與出發(fā)菌株相比，生長速率提高23.1%～52.3%，出菇提前10～14 d，表明紫外誘變能夠有效誘變食用菌菌株，利于優(yōu)良菌株篩選。紫外線穿透能力差，因此常與激光、離子束等誘變方法聯(lián)合使用，利于提高誘變效率。陳力力等[26]比較了紫外線、微波單因子對金針菇J05Y-c單細(xì)胞懸液的誘變效應(yīng)， 微波誘變的正突變率大于紫外誘變的正突變率，分別為85.00%和76.67%。采用最大功率700 W、脈沖頻率2 540 MHz的微波爐，以中等功率強度處理80 s，獲得HC值、菌絲生長量較出發(fā)菌株提高32.38%、62.16%的優(yōu)勢突變株W8011，連續(xù)8次傳代遺傳性能穩(wěn)定。

2.1.4 杏鮑菇。劉海英等[27]利用20 W 紫外燈（245 nm）對杏鮑菇（Pleurotus eryngii）菌株 PL7 的原生質(zhì)體進行了誘變，篩選出的20 株突變株與出發(fā)菌株 PL7 有明顯的拮抗作用，其中6 個菌株菌落生長速度提高了 11.0%～17.8%，液體培養(yǎng)生物量提高了 19.3%～32.4%，出菇試驗結(jié)果表明此6 個菌株較出發(fā)菌株長滿培養(yǎng)料天數(shù)縮短、產(chǎn)量有不同程度的提高；夏志蘭等[28]采用60Co-γ射線誘變杏鮑菇菌絲，在輻照劑量1 000 Gy、劑量率為 67.8 Gy/h的條件下，經(jīng)過拮抗試驗和酯酶同工酶電泳驗證，選育出1株杏鮑菇新菌株，誘變菌株較出發(fā)菌株的菌絲積累量差異均達到極顯著水平。由于X射線、γ射線等電離輻射穿透力強，危險性較高，對操作人員和環(huán)境存在潛在的危害，電離輻射技術(shù)誘變選育食用菌菌種的研究相對較少。

2.1.5 姬松茸。葉勛艷等[29]利用相似的試驗方法發(fā)現(xiàn)He-Ne激光對誘變姬松茸原生質(zhì)體也具有非常好的效果。比較分析2種激光對酵母菌的誘變發(fā)現(xiàn)，CO2激光誘變率（0.47%）較He-Ne激光誘變率（1.50%）低。

2.1.6 松乳菇。凡啟超等[30]用低能氮離子束注入松乳菇后，隨著輻照劑量的增加，菌株成活率呈現(xiàn)“馬鞍型”的趨勢；篩選出的誘變菌株Ld-135液體發(fā)酵生物量顯著高于出發(fā)菌株Ld-CK，突變菌株Ld-135和菌株Ld-180的胞內(nèi)多糖含量分別為1.27%和1.06%，較出發(fā)菌株顯著提高。

2.1.7 蟹味菇。董先茹等[31]采用氮離子束誘變蟹味菇菌株，篩選出優(yōu)質(zhì)突變菌株X-004，菌株的產(chǎn)量、麥角甾醇、蛋白質(zhì)和粗纖維含量在各誘變菌株中均為最高，產(chǎn)量達139.22 g，麥角甾醇在菌蓋中含量為4.228 mg/g，菌柄中為1.690 mg/g，蛋白質(zhì)和粗纖維含量分別達35.41%和23.29%。

2.1.8 猴頭菌。嚴(yán)濤等[32]以猴頭菌菌絲為材料，在較大劑量范圍對猴頭進行離子束注入，篩選到3株最適溫度下生長速度較快和3株較高溫度下生長速度較快的6個變異菌株，突變株菌絲的多糖、氨基酸含量均有提高。離子束誘變技術(shù)作為一項新技術(shù)，在誘變育種領(lǐng)域具有很大潛質(zhì)。

2.1.9 阿魏菇。陳恒雷等[33]嘗試用阿魏菇菌絲制備的單細(xì)胞為靶材，以離子束注入和激光輻照為復(fù)合誘變手段，采用營養(yǎng)缺陷型篩選辦法定性初篩，通過離子束注入誘變，獲得了2株菌絲體多糖產(chǎn)量較出發(fā)菌株提高了46.5%和75.2%的多糖高產(chǎn)菌PFPH-1和PFPH-2；在此基礎(chǔ)上，以激光輻照為復(fù)合誘變手段，獲得了1株菌絲體多糖產(chǎn)量較出發(fā)菌株P(guān)FPH-2提高了15.63%的多糖高產(chǎn)菌PFPH-3，表明離子束和激光復(fù)合誘變育種方法在改良阿魏菇多糖高產(chǎn)性狀方面誘變功效顯著。

2.2 物理誘變在藥用真菌育種中的應(yīng)用

由于藥用真菌研究起步較晚，大多研究集中在藥用真菌的藥用成分及其作用機理等方面，藥用真菌普遍存在生長周期較長、產(chǎn)量較低、價格較高等特點，很大程度上限制了藥用真菌的應(yīng)用，培育優(yōu)良菌種將有利于藥用真菌產(chǎn)量、有效成分等的提高。鑒于大多藥用真菌的遺傳背景、分子生物學(xué)信息等尚不清楚，遺傳轉(zhuǎn)化等最新生物技術(shù)尚不能應(yīng)用，而物理誘變能夠有效誘變藥用真菌，以下以桑黃、冬蟲夏草、灰樹花為例簡單介紹物理誘變在藥用真菌育種中的應(yīng)用，為其他藥用真菌的誘變育種提供參考。

2.2.1 桑黃。祝子坪等[34]、張赫男等[35]研究發(fā)現(xiàn)He-Ne激光-紫外復(fù)合誘變法處理桑黃原生質(zhì)體，篩選到多個生物量和多糖產(chǎn)量均高的菌株，較單一紫外誘變的正突變率高，因激光處理生物體產(chǎn)生了光效應(yīng)、熱效應(yīng)、電磁效應(yīng)等綜合作用，在誘變過程中使生物體產(chǎn)生染色體斷裂、易位、重組，從而產(chǎn)生新的遺傳變異，具有很好的應(yīng)用前景。

2.2.2 冬蟲夏草。盧翠文[36]利用紫外線、微波及其二者結(jié)合分別對北冬蟲夏草菌種進行誘變，以多糖含量為指標(biāo)，通過紫外40 s、微波5 s復(fù)合誘變，篩選到多糖含量比對照菌株高17%的突變菌株。盡管微波誘變在食用菌育種中的研究相對較少，但微波誘變已在工業(yè)微生物育種中取得較多進展[37-38]，將有效促進其在食用菌優(yōu)良菌種的選育。

2.2.3 灰樹花。Zhao等[39]利用宇宙輻射誘變灰樹花篩選到1株多糖高產(chǎn)突變株M270，在20 L的M270發(fā)酵液中，EPS含量達10.3 g/L，干菌絲重達17.9 g/L，該灰樹花M270突變體菌株是用于多糖生產(chǎn)的優(yōu)良菌株。

3 物理誘變育種的一般過程

由于藥食用真菌種類繁多，在進行菌種篩選時，應(yīng)根據(jù)具體藥食用真菌生長特性選擇合適的誘變方法，采用預(yù)試驗和大規(guī)模篩選相結(jié)合的方式有利于提高突變株的篩選效率。以下從物理誘變對象、誘變過程、菌種篩選、純化、鑒定等方面綜述物理誘變菌種的選育過程。

3.1 誘變對象

出發(fā)菌株的選擇對藥食用真菌誘變育種非常關(guān)鍵，選擇合適的出發(fā)菌株有利于提高育種效率。一般選擇具有較高應(yīng)用價值、未經(jīng)誘變但具有較好誘變效果的菌株作為出發(fā)菌株，更有利于提高誘變效率和誘變效果。

藥食用真菌誘變育種的對象主要是單倍體孢子和原生質(zhì)體。以孢子為誘變對象的優(yōu)勢體現(xiàn)在：①孢子是單細(xì)胞，可直接分離出孢子進行誘變處理；②對單倍體有性孢子誘變后，誘導(dǎo)染色體加倍可直接獲得純合突變株，提高了誘變效率。通常選擇未噴發(fā)孢子的藥食用真菌子實體，將其置于含有培養(yǎng)皿的干燥器中，待其自然噴發(fā)后收集孢子。但由于藥食用真菌孢子生長周期較長或不易培育，因而采用物理誘變處理孢子的研究相對較少，用于雜交育種的較多。

對于孢子難以得到或培育周期較長的藥食用真菌，以藥食用真菌菌絲原生質(zhì)體為誘變對象，具有取材容易、數(shù)量可控等優(yōu)點，便于誘變育種。通常選擇藥食用真菌營養(yǎng)生長階段的幼嫩菌絲，根據(jù)藥食用真菌菌絲細(xì)胞壁成分不同選擇不同水解酶組合、優(yōu)化酶解濃度，用于制備藥食用真菌原生質(zhì)體的酶包括溶壁酶、崩潰酶、纖維素酶、蝸牛酶等水解酶[40-41]，酶解出的原生質(zhì)體用于誘變育種。例如以對數(shù)生長期的香菇菌絲為材料，2%溶壁酶酶解2.5～3.0 h，香菇原生質(zhì)體產(chǎn)率達2.81×106個/mL[20]；采用生長了60 h的草菇菌絲，以1.5%的溶壁酶32 ℃酶解3 h，原生質(zhì)體數(shù)量達2.52×107個/mL[23]。

3.2 物理誘變處理

不同藥食用真菌種類、品種對不同物理誘變處理的敏感性都可能存在差異，因此，誘變處理前應(yīng)先做預(yù)試驗，粗略分析誘變方法、誘變劑量對誘變對象的致死率，一般選擇致死率在70%～80%的條件下，進行大量、多輪誘變處理。

紫外誘變處理時通常選擇黑暗條件下[42]操作（可選擇在紅光條件下），避免光復(fù)活，提高突變率。誘變處理后按不同稀釋濃度分別涂布平板，原生質(zhì)體要涂布在高滲培養(yǎng)基平板上，選擇含有篩選標(biāo)記的平板有利于篩選到目的性狀的菌種，提高篩選效率，篩選平板一般需避光培養(yǎng)1～2 d。

3.3 誘變后菌種篩選、純化

藥食用真菌誘變處理后常根據(jù)菌絲生長情況進行初篩，主要鑒別指標(biāo)包括菌落大小、形態(tài)、生長速度、顏色變化、菌絲密度、菌絲邊緣整齊度、菌落滲出物等。這些鑒別指標(biāo)通過肉眼即可分辨，在早期菌種篩選中發(fā)揮了重要作用。選擇合適的篩選標(biāo)記更有利于篩選、鑒定目標(biāo)菌株，例如在培養(yǎng)基中加入愈創(chuàng)木酚更容易鑒定分析漆酶合成相關(guān)基因發(fā)生突變的菌株，有利于提高轉(zhuǎn)化率、增加底物可利用率；在低溫條件下更有利于篩選到耐低溫菌株。

以藥食用真菌菌絲原生質(zhì)體或無性孢子（節(jié)孢子、分生孢子等）為誘變材料篩選優(yōu)良菌株，需要將篩選到的穩(wěn)定遺傳的菌株進一步純化，這是由于突變的隨機性，在2條同源染色體上的等位基因同時發(fā)生相同突變的概率極小，通常是一個雜合的菌體，最佳處理方法是先使誘變材料繁殖5～10代后，二次酶解這些混合的菌絲為原生質(zhì)體，然后再根據(jù)篩選標(biāo)記篩選突變株，這有利于提高篩選純化突變菌株的概率，最終篩選到遺傳性狀穩(wěn)定的突變菌。對于異宗結(jié)合的藥食用真菌，誘變處理單倍體孢子選育出誘變菌種后，需要對不同遺傳背景的單倍體孢子雜交后才能形成子實體。

3.4 突變菌株的鑒定

藥食用真菌的菌種選育是一項艱苦的工作，往往經(jīng)過多輪篩選僅獲得幾株差異顯著的菌株，這些菌株仍需要一些試驗鑒定。藥食用真菌的菌種鑒定常采用功能成分含量、拮抗試驗、同工酶技術(shù)，還可以采用基因組重測序、蛋白質(zhì)組分析、轉(zhuǎn)錄組分析等多種生物研究最新技術(shù)。

3.4.1 功能成分含量。根據(jù)誘變篩選目標(biāo)，通常選擇藥食用真菌中有保健、免疫、抗氧化等功能成分作為分析指標(biāo)，分析新菌株與出發(fā)菌株之間是否存在質(zhì)、量上的差異，例如灰樹花、桑黃菌株以多糖、萜類化合物為指標(biāo)。

3.4.2 拮抗試驗。拮抗試驗是鑒定子代基因與親本基因是否發(fā)生變化最常用的一種試驗，由于其對試驗操作要求不高、結(jié)果簡單明了，是初步鑒定新菌株的常用方法。拮抗現(xiàn)象是指1種菌絲在生長過程中產(chǎn)生了某些代謝產(chǎn)物從而對另外1種菌絲的生長有抑制或減弱作用。如果2種菌絲之間產(chǎn)生隔離、小溝或隆起等不相親和的現(xiàn)象，說明2種菌絲的基因有差異，若2種菌絲沒有發(fā)生拮抗試驗，不能排除2種菌絲之間有基因差異，可能在不控制拮抗現(xiàn)象的基因之間有差異，需要其他鑒定試驗驗證。

3.4.3 同工酶技術(shù)。生物體內(nèi)含有一些普遍存在的同工酶，具有催化相同反應(yīng)但分子結(jié)構(gòu)不同的酶，通過分析新菌株與出發(fā)菌株之間是否存在酶譜差異，鑒定這些菌株之間是否存在遺傳差異，是一種常用于鑒定生物體內(nèi)同工酶合成相關(guān)基因差異的技術(shù)。在藥食用真菌的菌種篩選、鑒定中應(yīng)用較多的同工酶主要有酯酶、乙醇脫氫酶、過氧化物酶、多酚氧化酶和漆酶等，被廣泛應(yīng)用于香菇、平菇、白靈菇、云芝等藥食用真菌的菌種鑒定。

4 展望

不同物理誘變方法在藥食用真菌優(yōu)良菌種的選育工作中發(fā)揮了重要作用，部分物理誘變機理有一定的研究，但大部分物理誘變研究還比較淺顯、誘變機理不甚清楚，育種工作仍存在很大的盲目性，今后應(yīng)深入研究這些物理誘變因素對菌種誘變的生化和分子生物學(xué)機理。伴隨著生物技術(shù)的發(fā)展，轉(zhuǎn)錄組測序、基因組重測序技術(shù)、蛋白質(zhì)組分析、生物信息等技術(shù)已在植物、動物、微生物的基礎(chǔ)研究中發(fā)揮了重要作用，利用這些技術(shù)能夠在DNA、RNA、蛋白水平上分析不同樣本間的差異，揭示重要基因與表型之間的關(guān)聯(lián)。目前，這些最新技術(shù)開始應(yīng)用在藥食用真菌的研究中，灰樹花、樟芝、平菇等藥食用真菌的全基因組測序已完成，轉(zhuǎn)錄組表達譜差異、蛋白表達差異分析將更有利于研究不同菌種間的差異，有望在藥食用真菌的誘變育種中發(fā)揮重要作用。

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