黨參總皂苷納米乳體外透皮性能及抗黑素瘤細胞研究

曹發(fā)昊 張百勝 馬家寧 王艷萍

摘要 [目的]研究黨參總皂苷納米乳處方組成，考察其體外透皮性能及抗黑素瘤細胞作用。[方法]根據(jù)藥物溶解性和偽三元相圖篩選黨參總皂苷納米乳處方，粒度分析儀測定其粒徑;以大鼠皮膚為模型，透皮擴散儀研究黨參總皂苷納米乳體外透皮性能;以黑素瘤B16細胞為靶細胞，MTT法和形態(tài)觀察法研究黨參總皂苷納米乳對黑素瘤細胞的毒性作用。[結果]黨參總皂苷納米乳處方確定為Cremophor EL40/PEG400/橄欖油/蒸餾水（質量比為28.66∶14.33∶8.25∶48.76），黨參總皂苷含量為44.75 mg/mL，粒徑為60.67 nm;黨參總皂苷納米乳12 h累積滲透量和穩(wěn)態(tài)滲透速率分別是黨參總皂苷水溶液的2.73、2.47倍;黨參總皂苷納米乳能促使黑素瘤細胞數(shù)量減少，出現(xiàn)空泡和細胞碎片，并且100～800 μg/mL黨參總皂苷納米乳對黑素瘤細胞增殖的抑制率大于相同濃度黨參總皂苷水溶液。[結論]確定了黨參總皂苷納米乳處方組成，它能增強黨參總皂苷透皮性能和抗黑素瘤作用，從而為納米乳開發(fā)黨參總皂苷透皮制劑提供參考。

關鍵詞 黨參總皂苷;納米乳;透皮性能;黑素瘤細胞

中圖分類號 S859.5+3文獻標識碼 A文章編號 0517-6611（2018）34-0001-04

黨參（Codonopsis pilosula）為桔梗科植物黨參等的干燥根，是我國傳統(tǒng)補益類中藥，現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)它具有延緩衰老、抗疲勞、抗缺氧、抗輻射、增強機體免疫力等功效[1-2]。黨參總皂苷是黨參發(fā)揮藥理功效的重要成分，具有降血脂、神經(jīng)保護、抗突變、抗炎等作用[3-6]。黑素瘤是一種高度惡性的腫瘤，大多原發(fā)于皮膚，易經(jīng)淋巴管或血液轉移[7]。黨參總皂苷對黑素瘤作用的研究鮮見報道，納米乳作為給藥載體具有許多優(yōu)點，已成為經(jīng)皮給藥研究的熱點[8-9]。皂苷本身是一類很好的天然乳化劑，在納米乳中可以作為藥物成分，且具有表面活性劑的性質，故其在納米乳藥物載體開發(fā)研究中有很好的應用潛力[10]。筆者研究了黨參總皂苷納米乳體外透皮性能和抗黑素瘤細胞作用，以期為黨參總皂苷透皮制劑的研究開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑。

黨參總皂苷，自制;Cremophor EL40，德國BASF;PEG400，西安天正藥用輔料有限公司;橄欖油，江西省吉水中南天然香料油廠;辛酸癸酸甘油三酯，武漢遠成共創(chuàng)科技有限公司;Tween-80、Span-80、1，2-丙二醇、甲醇，江蘇省海安石油化工廠;人參皂苷Re標準品，中國食品藥品檢定研究院;香草醛，西安拉維亞生物科技有限公司;高氯酸，天津市鑫源化工有限公司。

1.1.2 儀器。

Zetasizer Nano ZS激光粒度分析儀，英國Malvern Instrument公司;TT-6藥物透皮擴散儀，天津市正通科技有限公司;UV-2102型紫外分光光度計，尤尼柯儀器有限公司;128C酶標儀，奧地利CliniBio公司;CO2恒溫培養(yǎng)箱，日本三洋公司;倒置顯微鏡，上海光學儀器一廠。

1.1.3 試驗動物和細胞。SD大鼠，第四軍醫(yī)大學試驗動物中心;黑色素瘤B16細胞株，中國科學院上海細胞生物研究所。

1.2 方法

1.2.1 黨參總皂苷納米乳處方篩選。室溫下，將黨參總皂苷分別溶于表面活性劑（Cremophor EL40、Tween-80、Span-80）、助表面活性劑（PEG400、1，2-丙二醇）、油（辛酸癸酸甘油三酯、橄欖油）中，渦旋振蕩，直至不再溶解，測定藥物在各溶劑中的溶解情況。

將表面活性劑和助表面活性劑按質量比（Km）混勻，得到混合表面活性劑（Smix）;將油相（Oil）和Smix混勻，得到混合油相;在混合油相中緩慢滴加水相，不斷攪拌，直至形成透明的體系，記下體系發(fā)生透明或渾濁變化時的各組分用量，用origin8.5繪制偽三元相圖。根據(jù)納米乳區(qū)大小，篩選合適的納米乳體系。

1.2.2 黨參總皂苷含量測定。

人參皂甙Re標準品用甲醇溶解，配制1.2 mg/mL標準品母液。移取標準品母液30、60、90、120、150 μL于具塞試管中，60 ℃水浴中蒸干，經(jīng)香草醛-高氯酸-冰醋酸顯色反應后，以試劑空白（隨行處理的甲醇）為參比溶液，分光光度計測定吸光度，繪制標準曲線[11]。

移取待測樣品7 mL，用甲醇溶解定容到50 mL容量瓶中，從中移取120 μL經(jīng)香草醛-高氯酸-冰醋酸顯色反應后，分光光度計測定吸光度，計算樣品中黨參總皂苷的含量。

1.2.3 黨參總皂苷納米乳粒徑測定。樣品用蒸餾水稀釋后，激光粒度分析儀測定粒徑。

1.2.4 體外透皮試驗。黨參總皂苷用蒸餾水配成質量濃度44.70 mg/mL黨參總皂苷水溶液。在透皮擴散儀接收池中加入生理鹽水接收液，將鼠皮固定在擴散儀上，移取1 mL待測液加到供給池中，開啟擴散儀（溫度設定為37 ℃，轉速300 r/min），定時取樣，取樣后補加等體積接收液，分光光度計測定接受液中藥物含量，計算藥物累積滲透量Qn[12]。

1.2.5 體外抗黑素瘤細胞試驗。試驗分為無細胞對照組（只加不含細胞的培養(yǎng)液）、正常對照組和用藥組（空白納米乳組、黨參總皂苷水溶液組、黨參總皂苷納米乳組）。96孔板中每孔接種200 μL B16黑素瘤細胞懸液，37 ℃ 5%CO2培養(yǎng)，當細胞生長融合到70%～80%時，棄去原培養(yǎng)液，用藥組加入含藥培養(yǎng)液，正常對照組加入不含藥培養(yǎng)液。培養(yǎng)48 h后，每孔加入MTT溶液20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，棄培養(yǎng)液，每孔加入150 μL DMSO，避光振蕩10 min，酶標儀490 nm處測定A，計算細胞增殖抑制率。

細胞增殖抑制率=（1-A用藥組A正常對照組）×100%

1.2.6 數(shù)據(jù)分析。數(shù)據(jù)結果用±s表示。

2 結果與分析

2.1 黨參總皂苷納米乳處方篩選

2.1.1 黨參總皂苷溶解性試驗。

室溫下，黨參總皂苷在表面活性劑中溶解性排序依次為Cremophor EL40、Tween-80、Span-80;在助表面活性劑中溶解性排序依次為PEG400、1，2-丙二醇;在油相中溶解性排序依次為橄欖油、辛酸癸酸甘油三酯，故選擇Cremophor EL40、PEG400、橄欖油用于確定黨參總皂苷納米乳組成。

2.1.2 偽三元相圖研究納米乳形成。

分別以Cremophor EL40、PEG400、橄欖油和蒸餾水為表面活性劑、助表面活性劑、油相和水相，偽三元相圖考察了Cremophor EL40/PEG400質量比Km（2∶1、1∶1、1∶2）對納米乳形成的影響（圖1），圖中黑色部分代表納米乳區(qū)。納米乳區(qū)大小排序為（Km=2∶1）>（Km=1∶1）>（Km=1∶2）。

2.1.3 黨參總皂苷納米乳組成確定。

在相圖考察納米乳形成情況的基礎上，根據(jù)納米乳區(qū)的大小，初步篩選出Cremorphor EL40/PEG400/橄欖油/蒸餾水2個納米乳體系（Km=2∶1和Km=1∶1），測定藥物在其中的溶解情況。黨參總皂苷在Km=2∶1納米乳中的含量較高，最終確定黨參總皂苷納米乳的組成為黨參總皂苷/Cremophor EL40/PEG400/橄欖油/蒸餾水（質量比為4.50∶28.66∶14.33∶8.25∶48.76）。

2.2 黨參總皂苷含量

2.2.1 標準曲線繪制。

分別以吸光度A和標準品質量為縱坐標和橫坐標，繪制標準曲線（圖2）。標準曲線方程：A=4.533 3C+0.031 0（R = 0.999 6），在0.036～0.180 mg時線性關系好。

2.2.2 黨參總皂苷納米乳藥物含量。

選取3批次黨參總皂苷納米乳測定藥物含量，所得結果見表 納米乳中黨參總皂苷含量為44.75 mg/mL。

2.3 黨參總皂苷納米乳粒徑

粒徑測定結果見圖3，黨參總皂苷納米乳粒徑為60.67 nm，多分散指數(shù)PDI為0.347，粒徑介于10～100 nm，達到納米乳要求。

2.4 黨參總皂苷納米乳體外透皮性能

黨參總皂苷納米乳12 h體外透皮的累積滲透曲線見圖4。黨參總皂苷納米乳12 h累積滲透量為426.17 μg/cm 是黨參總皂苷水溶液（155.98 μg/cm2）的2.73倍。黨參總皂苷納米乳和黨參總皂苷水溶液的累積滲透曲線分別為Qn=37.53t-40.07、Qn=15.21t-27.23，兩者的穩(wěn)態(tài)滲透速率J分別為37.53、15.21 μg/（cm2·h），可見黨參總皂苷納米乳的穩(wěn)態(tài)滲透速率J是黨參總皂苷水溶液的2.47倍，這表明納米乳有助于提高黨參總皂苷的透皮性能。

2.5 黨參總皂苷納米乳體外抗黑素瘤細胞作用

2.5.1 細胞形態(tài)觀察。

空白對照組處理的黑素瘤細胞形態(tài)有梭形、多角形等，細胞飽滿，數(shù)量多（圖5A）;

和空白對照組相比，空白納米乳作用48 h后黑素瘤細胞的形態(tài)變化不大，有梭形、多角形，但細胞密度有所減少（圖5B）;黨參總皂苷水溶液組的黑素瘤細胞數(shù)量減少，細胞變圓皺縮，某些細胞出現(xiàn)空泡樣結構（圖5C）;和黨參總皂苷水溶液相比，黨參總皂苷納米乳作用48 h后，貼壁細胞數(shù)量明顯減少，大量細胞變圓，并且出現(xiàn)大空泡樣結構，甚至細胞膜發(fā)生破裂，培養(yǎng)液可見細胞碎片（圖5D）。

2.5.2 黨參總皂苷納米乳對黑素瘤細胞增殖的影響。

MTT法測定黨參總皂苷納米乳對黑素瘤細胞增殖的影響，結果見表2。100～800 μg/mL空白納米乳對黑素瘤細胞增殖的最大抑制作用為8.56%，按毒性分級法評價，空白納米乳對細胞的毒性為1級，達到合格要求[12]。100～800 μg/mL黨參總

皂苷納米乳對黑素瘤細胞增殖的抑制率大于相同濃度黨參總皂苷水溶液，這表明納米乳能增強黨參總皂苷對黑素瘤細胞增殖的抑制作用。

3 討論

納米乳主要是由表面活性劑、助表面活性劑、油相和水相在合適配比下形成的透明體系，正是在這4種主要納米乳成分作用下，藥物能很好地溶解在納米乳中[13]。筆者首先考察了多種溶劑對藥物的溶解情況，從而確定了合適的表面活性劑（Cremophor EL40）、助表面活性劑（PEG400）、油相（橄欖油），用于進一步篩選黨參總皂苷納米乳的組成。表面活性劑和助表面活性劑是納米乳的重要組成成分，主要是調節(jié)油水界面張力的，它們的配比對納米乳形成有很大影響，故用偽三元相圖研究納米乳形成情況，確定合適的表面活性劑和助表面活性劑質量比Km，從而確定黨參總皂苷納米乳的組成[14]。皂苷本身有一定的乳化特性，有資料報道了皂苷可以作為天然表面活性劑用于制備納米相關藥物[15]。后續(xù)工作可以針對皂苷天然表面活性制備納米乳進行研究，以降低納米乳中合成表面活性劑的用量，減輕其毒副作用。

該研究發(fā)現(xiàn)，納米乳能提高黨參總皂苷的透皮性能，可能是由于納米乳粒徑小，表面張力低，易于浸潤角質層，使角質層水化膨松，改變了角質層結構，細胞間隙擴大，形成了透皮的孔道;納米乳作為藥物儲存庫，增大了皮膚兩側藥物的滲透濃度[16-19]。在研究體外抗黑素瘤細胞作用時，空白納米乳對黑素瘤細胞的毒性等級為1級，表明空白納米乳藥物載體對黑素瘤細胞的安全性達到合格要求;黨參總皂苷納米乳對黑素瘤細胞增殖的抑制作用強于黨參總皂苷水溶液，表明納米乳能增強黨參總皂苷的抗黑素瘤細胞作用，原因可能在于納米乳粒徑小，含有表面活性劑，易于和細胞膜相互作用，利于藥物吸收;富集藥物，起到藥物貯存庫的作用[20]。后續(xù)工作需要深入研究黨參總皂苷納米乳和皮膚、黑素瘤細胞的作用機制，從而更好地解釋納米乳的透皮性能和抗黑素瘤細胞作用。

4 結論

黨參總皂苷納米乳組成為Cremophor EL40/PEG400/橄欖油/蒸餾水（質量比28.66∶14.33∶8.25∶48.76），黨參總皂苷含量為44.75 mg/mL，其粒徑為60.67 nm，多分散指數(shù)PDI為0.347;黨參總皂苷納米乳的透皮性能和抗黑素瘤細胞增殖作用強于黨參總皂苷水溶液，從而為利用納米乳藥物載體開發(fā)黨參總皂苷透皮制劑提供依據(jù)。

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