煙草β—1，3—葡聚糖酶的生物學(xué)分析

馬世明 羅家佐 王德勛 戶艷霞 范志勇 蘇家恩

摘要 [目的]以煙草β-1，3-葡聚糖酶的氨基酸序列為材料，對其特性進(jìn)行深度挖掘。[方法]采用NCBI-PROTEIN篩選蛋白序列，依次運(yùn)用ProtParam、SignalP 4.1和TMHMM 2.0工具進(jìn)行預(yù)測并分析煙草葡聚糖酶的理化特性、信號肽和跨膜結(jié)構(gòu)的組成成分。[結(jié)果]NtBGl-2的分子量最大（40 390.76 Dk），NtBGl-3的分子量最?。?7 722.64 Dk）；NtBGl-1和NtBGl-2的等電點(diǎn)小于7.0，而NtBGl-3的等電點(diǎn)大于7.0；NtBGl-1和NtBGl-2屬于不穩(wěn)定蛋白，NtBGl-3屬于穩(wěn)定性蛋白，且耐熱性大于NtBGl-1和NtBGl-2；NtBGl-1和NtBGl-2的優(yōu)勢氨基酸為甘氨酸和絲氨酸，NtBGl-3的為天冬酰氨和丙氨酸；NtBGl均含有信號肽，屬于分泌蛋白；NtBGl-1無跨膜區(qū)，而NtBGl-2（13 ～35）和NtBGl-3（7 ～29）含有跨膜結(jié)構(gòu)區(qū)域，屬于跨膜蛋白。[結(jié)論]該研究為深入研究煙草葡聚糖酶奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 煙草；β-1，3-葡聚糖酶；生物學(xué)

中圖分類號 S-3 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 0517-6611（2018）17-0096-02

Abstract [Objective] The amino acid sequence of tobacco β1，3glucanase was used as a material to deeply explore its characteristics. [Method]NCBIPROTEIN was used to screen protein sequences， and ProtParam， SignalP 4.1 and TMHMM 2.0 tools were used to predict physicochemical properties， signal peptide and transmembrane structure of tobacco glucan enzyme. [Result]The molecular weight of NtBGl2 was the maximum （40 390.76 Dk）， and that of NtBGl3 was the minimum （37 722.64 Dk）； the isoelectric point of NtBGl1 and NtBGl2 was less than 7.0， but NtBGl3 was more than 7.0； NtBGl1 and NtBGl2 were unstable proteins， NtBGl3 was a stable protein， and the heat resistance was greater than that of NtBGl1 and NtBGl2； the dominant amino acids of NtBGl1 and NtBGl2 were glycine and serine， NtBGl3 for asparagine and alanine； NtBGl contained signal peptide， belonged to secreted proteins； NtBGl1 had no transmembrane domain， while NtBGl2 （13 ～35） and NtBGl3 （7 ～29） contained transmembrane structure， and belonged to transmembrane proteins.[Conclusion]This study lays the foundation for indepth study of tobacco glucanase.

Key words Tobacco； β 1，3 Glucan； Biology

β-1，3-葡聚糖酶具有水解β型的1，3糖苷鍵的葡聚糖聚合體的作用[1-2]，由于葡聚糖是植物細(xì)胞壁的重要組成部分，因此葡聚糖酶具有促進(jìn)植物體軟化的作用[3]。此外，葡聚糖酶具有抵抗部分細(xì)菌和真菌的入侵[4-6]。正常情況下，葡聚糖酶較少在植物體內(nèi)積累，且活性較低，當(dāng)受到病原微生物入侵時(shí)，葡聚糖酶的表達(dá)量增加，在體內(nèi)大量合成，同時(shí)產(chǎn)生部分同工酶，進(jìn)而發(fā)揮抵抗病原菌入侵的作用[7-9]，如水稻被稻瘟菌感染，誘導(dǎo)葡聚糖酶的活性增加3～5倍[10]；煙草的壞疽病感染黃瓜葉，促使葡聚糖酶的活性增加6倍[11]。

目前，關(guān)于煙草葡聚糖酶的研究主要集中在其抵抗病原微生物，主要包括花葉病[12]、疫霉病[13]、立枯絲核菌[14]、壞疽病[11]等。為更深層次地認(rèn)識煙草β-1，3-葡聚糖酶的生物學(xué)特性，筆者利用生物信息學(xué)的方法進(jìn)行研究，進(jìn)而為深入研究煙草葡聚糖酶奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 篩選煙草β-1，3-葡聚糖酶家族成員

采用NCBI-PROTEIN[15]數(shù)據(jù)庫在線檢索，篩選煙草葡聚糖酶相關(guān)的蛋白序列，獲取的登錄號分別是AAA63541.1、ACF93731.1和AAA63542.1，依據(jù)優(yōu)勢氨基酸和氨基酸數(shù)進(jìn)行命名，分別為NtBGl-1、NtBGl-2和NtBGl-3[16]。

1.2 方法 以ProtParam的工具[17]測定序列的理化特性，如煙草葡聚糖酶的氨基酸數(shù)、分子量、理論等電點(diǎn)、不穩(wěn)定指數(shù)、脂肪族指數(shù)和優(yōu)勢氨基酸；使用SignalP 4.1的在線服務(wù)[18]，其D-cutoff值以Matthews的相關(guān)系數(shù)進(jìn)行測定；采用TMHMM 2.0工具[19]，根據(jù)疏水性氨基酸，對煙草葡聚糖酶的跨膜結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 煙草β-1，3-葡聚糖酶理化特性的分析

通過在線工具（PROTPARAM）預(yù)測NtBGl的相關(guān)理化特性，結(jié)果顯示（表1），NtBGl-2的氨基酸數(shù)最多（370），其次是NtBGl-1，為359個(gè)，NtBGl-3的最小，含有343個(gè)氨基酸；對于煙草葡聚糖酶，以NtBGl-2的分子量最大，其分子量為40 390.76 Da，而NtBGl-3的分子量最?。?7 722.64 Da）；通過測定煙草葡聚糖酶的等電點(diǎn)，NtBGl-1和NtBGl-3的等電點(diǎn)分別為6.60和5.12，均屬于酸性蛋白，而NtBGl-2的等電點(diǎn)值最大（7.10），屬于堿性蛋白；NtBGl-1和NtBGl-2的不穩(wěn)定指數(shù)均大于40，其值分別為42.49和44.28，因此NtBGl-1和NtBGl-2屬于不穩(wěn)定性蛋白，而NtBGl-3的不穩(wěn)定指數(shù)為37.47，即NtBGl-3屬于穩(wěn)定性蛋白；NtBGl-3的脂肪族指數(shù)最大（90.20），說明NtBGl-3的耐熱性大于NtBGl-1和NtBGl-2；NtBGl-1和NtBGl-2的優(yōu)勢氨基酸相同，均為甘氨酸（含量分別為9.2%、8.9%）和絲氨酸（含量分別為9.2%、9.5%），NtBGl-3的優(yōu)勢氨基酸為天冬酰氨（9.6%）和丙氨酸（10.2%）。

2.2 煙草β-1，3-葡聚糖酶的信號肽分析

從信號肽、原始的剪切位點(diǎn)和綜合的剪切位點(diǎn)3個(gè)方面分析煙草葡聚糖酶的信號肽發(fā)現(xiàn)（圖1），NtBGl-1第10位亮氨酸的信號肽值（S）達(dá)到最大（0.970），而原始的剪切位點(diǎn)（C）和綜合的剪切位點(diǎn)（Y）的最大分值均處于第22位谷氨酰胺，其值分別為0.810和0.856，因此NtBGl-1具有信號肽，剪切位點(diǎn)處于第21與22位氨基酸之間，信號肽處于第1～21位的氨基酸，該信號肽的均值為0.902；NtBGl-2的信號肽值于第20位亮氨酸處達(dá)到最大（0.957），原始的剪切位點(diǎn)和綜合的剪切位點(diǎn)的最大分值均處于第33位谷氨酰胺，其值分別為0.742和0.795，即NtBGl-2具有信號肽，剪切位點(diǎn)處于第32～33位氨基酸，信號肽處于第1～32位的氨基酸，該信號肽的均值為0.846；NtBGl-3的信號肽值于第9位苯丙氨酸處達(dá)到最大（0.986），原始的剪切位點(diǎn)和綜合的剪切位點(diǎn)的最大分值均處于第30位谷氨酰胺，其值分別為0.615和0.753，表明NtBGl-3具有信號肽，剪切位點(diǎn)處于第29與30位氨基酸之間， 且信號肽處于第1～29位的氨基酸，該信號肽的均值為0.929。綜上所述，煙草葡聚糖酶均具有信號肽，即屬于分泌蛋白。

2.3 煙草β-1，3-葡聚糖酶的跨膜結(jié)構(gòu)分析

蛋白酶可通過跨膜結(jié)構(gòu)錨定于質(zhì)膜上，進(jìn)而在亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的特定區(qū)域參與信號傳遞或代謝活動，因此對NtBGl的跨膜結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，結(jié)果顯示（圖2），NtBGl-1序列位于膜內(nèi)的氨基酸數(shù)為3.50，小于20.00，即NtBGl-1不具有跨膜結(jié)構(gòu)；NtBGl-2和NtBGl-3位于膜內(nèi)序列的氨基酸數(shù)分別為20.97和22.74，均大于20.00，表明NtBGl-2和NtBGl-3含有跨膜結(jié)構(gòu)，其概率分別為0.947和0.993；NtBGl-2的第1～12位氨基酸位于

膜內(nèi)，第13 ～35位氨基酸為跨膜區(qū)，第36～370位的氨基酸處于膜外；NtBGl-3的第1～6位氨基酸位于膜內(nèi)，第7～29位氨基酸為跨膜區(qū)，第30～343位的氨基酸處于膜外。綜上所述，除NtBGl-1外，NtBGl含有跨膜結(jié)構(gòu)。

3 結(jié)論與討論

通過理化特性分析，NtBGl-2等電點(diǎn)大于7.0，因此，NtBGl-2可能定位于液泡，且具有降解病原菌菌絲的功能[20]，但NtBGl-2屬于不穩(wěn)定性蛋白，因此NtBGl-2可能誘導(dǎo)同工酶、幾丁質(zhì)、核糖體等共同作用，進(jìn)行抵抗病原微生物[7-8]；NtBGl均屬于分泌蛋白，具有信號肽，從而指引煙草葡聚糖酶運(yùn)輸于特定區(qū)域，參與相應(yīng)的抗性反應(yīng)[21]；NtBGl-2（第13 ～35位氨基酸）和NtBGl-3（7 ～29）均含有跨膜結(jié)構(gòu)，因此，NtBGl-2和NtBGl-3可能參與信號的傳遞[22]。

參考文獻(xiàn)

[1] 蔣選利，李振岐，康振生.β-1，3-葡聚糖酶與植物的抗病性[J].西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2005， 14（4）：135-139.

[2] DOXEY A C，YAISH M W F，MOFFATT B A，et al.Functional divergence in the Arabidopsis β1，3glucanase gene family inferred by phylogenetic reconstruction of expression states[J]. Molecular biology &evolution，2007，24（4）：1045-1055.

[3] CHOURASIA A，SANE V A，SINGH R K，et al.Isolation and characterization of the MiCel1 gene from mango：Ripening related expression and enhanced endoglucanase activity during softening[J]. Plant growth regulation，2008，56（2）：117-127.

[4] 歐陽波，李漢霞，葉志彪.植物β-1，3-葡聚糖酶及其基因[J].中國生物工程雜志，2002，22（6）：18-23.

[5] 劉愛新，董漢松，梁元存，等.煙草幾丁酶β-1，3-葡聚糖酶的抑菌作用[J].微生物學(xué)通報(bào)，1999，26（1）：15-17.

[6] COLLINGE D B，SLUSARENKO A J.Plant gene expression in response to pathogens[J].Plant molecular biology，1987，9（4）：389-410.

[7] 左豫虎，康振生，楊傳平，等.β-1，3-葡聚糖酶和幾丁質(zhì)酶活性與大豆對疫霉根腐病抗性的關(guān)系[J].植物病理學(xué)報(bào)，2009，39（6）：600-607.

[8] LAWRENCE C B，JOOSTEN M H A J，TUZUN S.Differential induction of pathogenesis-related proteins in tomato by Alternaria solani and the association of a basic chitinase isozyme with resistance[J]. Physiological &molecular plant pathology，1996，48（6）：361-377.

[9] LAWRENCE C B，SINGH N P，QIU J S，et al.Constitutive hydrolytic enzymes are associated with polygenic resistance of tomato to Alternaria solani and may function as an elicitor release mechanism[J]. Physiological &molecular pant pathology，2000，57（5）：211-220.

[10] 杜良成，王鈞.稻瘟菌誘導(dǎo)的水稻幾丁酶、β-1.3-葡聚糖酶活性及分布[J].植物生理與分子生物學(xué)學(xué)報(bào)，1992，18（1）：29-36.

[11] REPKA V，TAMS L，F(xiàn)ISCHEROV I，et al.Identification and partial characterization of beta1，3glucanase from virusinfected cucumber cotyledons[J].Acta virologica，1997， 41（1）：35-39.

[12] KANG M K，PARK K S，CHOI D.Coordinated expression of defenserelated genes by TMV infection or salicylic acid treatment in tobacco[J].Molecules &cells，1998，8（4）：388-392.

[13] PAZ LAGO D，GUTIERREZ A，LUZARDO L.Biological relevance of the enzyme beta 1，3 glucanase on the activation of systemic resistance of tobacco induced by the fungal cell wall[J].Cultivos tropicales，1998，19（3）：25-27.

[14] 遲彥.大豆β-1，3-葡聚糖酶基因轉(zhuǎn)化煙草及抗病性的研究[J].大連大學(xué)學(xué)報(bào)，2001， 22（6）：37-41.

[15] SAYERS E.NCBI protein resources：The NCBI handbook[M].Bethesda：National Center for Biotechnology Information，2013.

[16] 陳二龍，蘇家恩，范志勇，等.Bright Yellow 2烤煙熱激蛋白90生物信息學(xué)分析[J].南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2017，48（10）：1734-1740.

[17] SEZUTSU H，KAJIWARA H，KOJIMA K，et al.Identification of four major hornet silk genes with a complex of alaninerich and serinerich sequences in Vespa simillima xanthoptera Cameron[J].Bioscience biotechnology &biochemistry，2007，71（11）：2725-2734.

[18] BENDTSEN J D，NIELSEN H，WIDDICK D，et al.Prediction of twin-arginine signal peptides[J].BMC Bioinformatics，2005，6（1）：167.

[19] KROGH A，LARSSON B，VON HEIJNE G，et al.Predicting transmembrane protein topology with a hidden markov model：Application to complete genomes[J].Journal of molecular biology，2001，305（3）：567-580.

[20] ANFOKA G，BUCHENAUER H.Systemic acquired resistance in tomato against Phytophthora infestans by preinoculation with tobacco necrosis virus[J].Physiological &molecular plant pathology，1997，50（2）：85-101.

[21] 何江峰，韓冰，趙宏鑫.植物β-1，3-葡聚糖酶的研究進(jìn)展[J].內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)科技，2006（5）：21-25.

[22] 方靜平，蘇亞春，游倩，等.甘蔗β-1，3-葡聚糖酶基因的電子克隆與分析[J].生物信息學(xué)， 2012，10（3）：199-207.