新優(yōu)綠化植物冬紅離體培養(yǎng)與組培快繁技術(shù)研究

余平福 藍(lán)學(xué) 覃林海

摘要 [目的]建立冬紅組培再生體系。[方法]從外植體消毒、外植體出芽誘導(dǎo)、無(wú)菌芽繼代增殖、壯苗、生根、移栽等方面建立冬紅組培再生體系。[結(jié)果]用75%乙醇30 s+0.1%HgCl2 10 min+0.2%HgCl2 5 min進(jìn)行外植體消毒效果最好；較好的外植體出芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+ 6-BA 0.2 mg/L+ IBA 0.4 mg/L+蔗糖3.0%，誘導(dǎo)率為80%；繼代增殖培養(yǎng)基：改良MS +6-BA 0.5 mg/L+ KT 0.5 mg/L +NAA 0.2 mg/L+蔗糖4.0%的有效苗最多，增殖系數(shù)為3.8；壯苗培養(yǎng)基以改良MS +6-BA 0.1 mg/L+NAA 0.2 mg/L +蔗糖3.0%的效果最好；生根培養(yǎng)基1/3MS+NAA 0.5 mg/L+蔗糖1.5%的生根率最高，達(dá)85%；移栽基質(zhì)以泥炭土∶黃泥∶河沙（V∶V∶V=1∶1∶1）的混合基質(zhì)較好，30 d后移栽成活率高達(dá)90%。[結(jié)論]該研究基本建立了冬紅組培快繁技術(shù)體系，為實(shí)現(xiàn)冬紅組培苗木批量化生產(chǎn)奠定了理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 冬紅；組培快繁；增殖；壯苗；生根；移栽

中圖分類號(hào) S723.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2018）18-0083-03

Technical System of Tissue Culture on Holmskioldia sanguinea Retz.

YU Pingfu， LAN Xue， QIN Linhai

（Guangxi Weidu State Forest Farm， Laibin， Guangxi 546100）

Abstract [Objective]To establish the tissue regeneration system of Holmskioldia sanguinea Retz. .[Method]A technique system of tissue culture of H. sanguinea Retz.was established from the aspect of explant disinfection，sterile bud proliferation，strong seedling， rooting and transplanting.[Result]The best sterilization method was 75% alcohol 30 s+0.1%HgCl2 10 min+0.2%HgCl2 5 min；explants induction media was MS+ 6BA 0.2 mg/L+ IBA 0.4 mg/L+ sucrose （3.0%）， induction rate was 80%；subculture multiplication media was modified MS +6BA 0.5 mg/L+ KT 0.5 mg/L +NAA 0.2 mg/L + sucrose （4.0%）， multiplication coefficients reached 3.8；growthpromoting culture media was modified MS+6BA 0.1 mg/L+NAA 0.2 mg/L +sucrose （3.0%）；rooting culture media was 1/3MS+ NAA 0.5 mg/L +sucrose （1.5%）， and the rooting rate was up to 85%；the best transplantation media was peaty soil ， yellow soil and fine sand mixture matrix （V∶V∶V=1∶1∶1）， and transplanting survival rate could reach 90% after 30 days .[Conclusion]This study basically established the rapid propagation technology system of H. sanguinea Retz.， which laid a theoretical foundation for the realization of the batch production of seedlings of H. sanguinea Retz..

Key words Holmskioldia sanguinea Retz.；Tissue culture；Multiplication；Buds growthpromoting；Rooting；Transplantation

冬紅（ Holmskioldia sanguinea Retz.）原產(chǎn)于喜馬拉雅，為馬鞭草科冬紅屬植物，又名陽(yáng)傘花、帽子花，花頂生，聚傘花序，花冠呈彎曲筒狀而微扁平，橙紅色，它的花在冬季依然能呈現(xiàn)出絢麗的紅色，極為鮮艷奪目，故而得名[1]。冬紅枝條伸長(zhǎng)具蔓性，耐修剪，適用于花架、花廊、坡墻和圍籬綠化、盆栽等，可在我國(guó)的熱帶和南亞熱帶地區(qū)栽培[1]。由于冬紅是難得的冬季開(kāi)花植物，景觀價(jià)值高且適應(yīng)性強(qiáng)，且種植范圍廣，因此是城市綠化和鄉(xiāng)村美化的優(yōu)良種質(zhì)資源[2]，市場(chǎng)上對(duì)其苗木需求量大。通過(guò)組培快繁技術(shù)，可實(shí)現(xiàn)短周期、大批量地推廣冬紅優(yōu)質(zhì)種苗，滿足市場(chǎng)需求。在冬紅組培快繁方面，國(guó)內(nèi)鮮有相關(guān)研究報(bào)道。筆者以冬紅帶腋芽莖段為外植體，研究冬紅組培關(guān)鍵技術(shù)，擬建立一套成熟的冬紅組培再生體系，填補(bǔ)相關(guān)方面的技術(shù)空白，為批量化生產(chǎn)冬紅組培苗木提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料（外植體）為冬紅長(zhǎng)勢(shì)健壯、無(wú)病蟲(chóng)害、半木質(zhì)化的帶腋芽枝條。外植體采集應(yīng)盡量選擇在連續(xù)晴天3 d以上的天氣，于中午進(jìn)行。

1.2 外植體消毒及培養(yǎng)

摘去外植體葉片，剪成合適長(zhǎng)度的帶芽莖段，進(jìn)行消毒處理。在無(wú)菌條件下，使用75%乙醇、0.1%HgCl2、0.2% HgCl2和NaClO共4種滅菌劑，設(shè)置不同的滅菌劑濃度和滅菌時(shí)間組合（表1），將滅菌的外植體最后用無(wú)菌蒸餾水沖洗6遍，風(fēng)干后接入MS基本培養(yǎng)基中。每個(gè)處理50瓶，每瓶接入1芽。10 d后觀察結(jié)果，統(tǒng)計(jì)污染率，進(jìn)行對(duì)比分析，篩選出最佳外植體消毒方法。

1.3 誘導(dǎo)及繼代培養(yǎng)

培養(yǎng)基以MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，根據(jù)無(wú)菌苗的生長(zhǎng)狀況和培養(yǎng)需要進(jìn)行適當(dāng)改良，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH至5.8，瓊脂6%，附加生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑6-BA、KT、IBA、NAA等。

1.3.1

外植體出芽誘導(dǎo)培養(yǎng)。將消毒獲得的無(wú)菌外植體分別轉(zhuǎn)接到出芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，出芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基以MS為基本培養(yǎng)基，蔗糖3.0%，生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑配比如下：C1，6-BA 0.1 mg/L+ IBA 0.2 mg/L；C2，6-BA 0.2 mg/L+ IBA 0.4 mg/L；C3，6-BA 0.5 mg/L+ IBA 1.0 mg/L。每個(gè)處理20個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)1個(gè)外植體，20 d后統(tǒng)計(jì)誘導(dǎo)率。

1.3.2

增殖培養(yǎng)。將無(wú)菌芽單個(gè)切下，接種至增殖培養(yǎng)基中。增殖培養(yǎng)以改良的MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，蔗糖4.0%，生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑配比如下：C4，6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L；C5，6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L；C6，6-BA 2.0 mg/L+ NAA 0.5 mg/L；C7，6-BA 0.5 mg/L+ KT 0.5 mg/L +NAA 0.2 mg/L。每個(gè)處理20個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)1個(gè)芽，20 d后統(tǒng)計(jì)增殖系數(shù)，增殖系數(shù)=增殖所得芽數(shù)/接入的外植體總數(shù)。

1.3.3

壯苗培養(yǎng)。壯苗培養(yǎng)基以改良的MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，蔗糖3.0%，生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑配比如下：C8，6-BA 0.1 mg/L+NAA 0.2 mg/L；C9，6-BA 0.1 mg/L+IBA 0.2 mg/L；C10，NAA 0.2 mg/L；C11，IBA 0.2 mg/L。將增殖培養(yǎng)獲得的不夠健壯的無(wú)菌叢芽單個(gè)切下，接種至壯苗培養(yǎng)基中，每個(gè)處理20個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)1個(gè)芽，20 d后觀察苗的生長(zhǎng)情況。

1.3.4

生根培養(yǎng)。選取健壯、高度為4～6 cm的無(wú)菌苗進(jìn)行生根培養(yǎng)。培養(yǎng)基以1/3 MS為基本培養(yǎng)基，蔗糖1.5%，所含生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑如下：C12，NAA 0.5 mg/L；C13，NAA 1.0 mg/L；C14，IBA 0.5 mg/L；C15，IBA 1.0 mg/L。每個(gè)處理20個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)1個(gè)芽，20 d后統(tǒng)計(jì)生根率。

1.4 煉苗移栽

當(dāng)生根苗在培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)具3～4根長(zhǎng)約2 cm的根系時(shí)，即可出瓶移栽，出瓶前煉苗3～5 d。移栽基質(zhì)采用以下3個(gè)配比：C16，黃泥；C17，泥炭土∶黃泥（V∶V=1∶1）；C18，泥炭土∶黃泥∶河沙（V∶V∶V=1∶1∶1）。每個(gè)處理移20株苗，放置育苗棚內(nèi)，進(jìn)行同樣的水肥管理，分別于15、30 d后統(tǒng)計(jì)移栽成活率。

2 結(jié)果與分析

2.1 外植體消毒效果

不同的消毒處理效果差異明顯。由表1可知，當(dāng)使用75%乙醇和NaClO消毒時(shí)，污染率最高，效果達(dá)不到預(yù)期，消毒處理后，外植體上還有很多存活的霉菌和細(xì)菌。在設(shè)置的4種消毒處理中，污染率最低的為處理3，但是其存活率極低，外植體大部分褐變死亡。處理4（75%乙醇30 s+0.1%HgCl2 10 min+0.2%HgCl2 5 min）的效果最好，在獲得較低污染率的同時(shí)，保證了存活率，且所得無(wú)菌外植體依然保有活力。

2.2 不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑濃度對(duì)外植體出芽誘導(dǎo)的影響

3種培養(yǎng)基上冬紅外植體的出芽誘導(dǎo)率見(jiàn)表2。C1和C2培養(yǎng)基都能成功誘導(dǎo)外植體長(zhǎng)新芽且無(wú)愈傷，接種20 d后新芽長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng)壯，但C2培養(yǎng)基誘導(dǎo)率明顯高于C1培養(yǎng)基。相反，C3培養(yǎng)基可能由于生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑濃度過(guò)高，外植體上產(chǎn)生大量愈傷組織，出芽誘導(dǎo)率最低，芽畸形，新葉卷曲玻璃化?？芍?，用C2培養(yǎng)基（MS+6-BA 0.2 mg/L+IBA 0.4 mg/L）對(duì)冬紅外植體進(jìn)行出芽誘導(dǎo)培養(yǎng)效果最好。

2.3 不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑濃度對(duì)繼代增殖的影響

由表3可知，生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑濃度是影響無(wú)菌芽增殖的關(guān)鍵因素，無(wú)菌芽的增殖隨著細(xì)胞分裂素總濃度的升高而增多，當(dāng)6-BA濃度為2.0 mg/L，NAA濃度為0.5 mg/L時(shí)，無(wú)菌芽的增殖系數(shù)最高，獲得的叢芽最多，但是有效苗較少，分生芽的生長(zhǎng)受到抑制，生長(zhǎng)較慢，長(zhǎng)勢(shì)弱。綜合而言，效果最好的增殖配方是C7培養(yǎng)基（6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L+KT 0.5 mg/L），細(xì)胞分裂素6-BA、KT和生長(zhǎng)素NAA配合使用，增殖芽苗生長(zhǎng)健壯，畸形苗率低，增殖系數(shù)較高，平均增殖系數(shù)為3.8，是誘導(dǎo)增殖的理想生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑配比，增殖效果如圖1所示。

2.4 不同生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑濃度對(duì)壯苗培養(yǎng)的影響

對(duì)于部分增

殖獲得的不夠健壯的無(wú)菌芽叢進(jìn)行復(fù)壯培養(yǎng)，結(jié)果見(jiàn)表4。合適濃度的生長(zhǎng)素和低濃度細(xì)胞分裂素6-BA配合使用，能夠有效促進(jìn)冬紅無(wú)菌苗復(fù)壯。從試驗(yàn)結(jié)果可知，生長(zhǎng)素NAA比IBA的促生效果更好，當(dāng)0.2 mg/L NAA配合0.1 mg/L 6-BA使用時(shí)，無(wú)菌芽的復(fù)壯效果最好，生長(zhǎng)快且健壯，增殖獲得的小芽葉片濃綠有光澤，可用于再次增殖培養(yǎng)或者直接用于生根。單獨(dú)使用生長(zhǎng)素的效果不及生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素配合使用，當(dāng)培養(yǎng)基中僅添加0.2 mg/L NAA時(shí)，無(wú)菌芽生長(zhǎng)快，但是芽纖細(xì)且基部產(chǎn)生愈傷較多，不利于生根培養(yǎng)或繼代增殖；當(dāng)培養(yǎng)基中僅添加0.2 mg/L IBA時(shí)，無(wú)菌芽有一定程度的復(fù)壯，但是生長(zhǎng)較慢。

2.5 不同生根劑處理對(duì)無(wú)菌苗不定根發(fā)生的影響

4種不同濃度生根劑對(duì)冬紅無(wú)菌苗不定根發(fā)生的影響見(jiàn)表5。NAA處理的生根效果明顯好于IBA，其生根率高，根系粗壯旺盛，當(dāng)NAA濃度為0.5 mg/L時(shí)，生根率最高，達(dá)85%。IBA處理的生根率都較低，根系均少且弱。不同批次的試驗(yàn)結(jié)果表明，生根效果除了與生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑有關(guān)系外，無(wú)菌苗本身的因素也有影響，不同繼代次數(shù)的無(wú)菌苗經(jīng)同樣的生根劑處理后，生根率會(huì)有差異，這可能與組培苗的木質(zhì)化程度、體內(nèi)的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑積累等因素有關(guān)。針對(duì)不同繼代苗的生長(zhǎng)特性，對(duì)生根劑處理和培養(yǎng)基進(jìn)行適當(dāng)?shù)恼{(diào)整，生根率基本保持在80%以上。圖2為在C12培養(yǎng)基上，冬紅無(wú)菌苗根系發(fā)達(dá)粗壯。

2.6 煉苗移栽

當(dāng)生根組培苗經(jīng)過(guò)開(kāi)瓶煉苗后，洗凈培養(yǎng)基，分別栽種到3種經(jīng)過(guò)消毒的基質(zhì)中，移栽試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表6。由表6可知，不同基質(zhì)中的移栽成活率不同，其中全黃泥的成活率最低，30 d時(shí)的成活率為70%，泥炭土∶黃泥∶河沙以體積比為1∶1∶1的混合基質(zhì)最適合冬紅組培苗的生長(zhǎng)，30 d時(shí)已完全適應(yīng)土壤基質(zhì)和溫室環(huán)境，生長(zhǎng)健壯，抽出新梢，成活率高達(dá)90%。

3 結(jié)論與討論

通過(guò)對(duì)冬紅離體培養(yǎng)進(jìn)行系統(tǒng)研究，建立冬紅組培快繁技術(shù)體系如下：外植體消毒滅菌的最佳方法為75%乙醇30 s+0.1%HgCl2 10 min+0.2%HgCl2 5 min，外植體出芽誘導(dǎo)最佳培養(yǎng)基為MS+6-BA 0.2 mg/L+IBA 0.4 mg/L+蔗糖3.0%；繼代增殖培養(yǎng)基以改良MS +6-BA0 .5 mg/L+KT 0.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L+蔗糖4.0%的效果最好；最適壯苗培養(yǎng)基為改良MS+6-BA 0.1 mg/L+NAA 0.2 mg/L+蔗糖3.0%；生根培養(yǎng)基以1/3MS+ NAA 0.5 mg/L+蔗糖1.5%的效果最好；泥炭土∶黃泥∶河沙（V∶V∶V=1∶1∶1）混合基質(zhì)是最適移栽基質(zhì)。

培養(yǎng)材料的消毒是組織培養(yǎng)過(guò)程中的一個(gè)重要環(huán)節(jié)，是決定組織培養(yǎng)成敗的關(guān)鍵。該研究中外植體采用冬紅帶腋芽莖段，帶菌較多，對(duì)于這樣的外植體，使用75%乙醇和NaClO進(jìn)行滅菌，效果達(dá)不到預(yù)期。HgCl2的消毒效果優(yōu)于NaClO，一般采用0.1%～0.2%消毒效果最好，但是其消毒時(shí)間較難掌握，當(dāng)濃度低、消毒時(shí)間短時(shí)，消毒效果不理想，若濃度高、消毒時(shí)間長(zhǎng)，則外植體褐化死亡，采用分段消毒法（濃度和消毒時(shí)間）可緩解這一矛盾，獲得更好的滅菌效果[3-4]。

合理的生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑配比是成功篩選獲得各階段成熟配方的關(guān)鍵。沈海龍[5]、胡繁榮[6]指出：要促進(jìn)叢生芽的形成，就要提高細(xì)胞分裂素與生長(zhǎng)素的比值，但濃度不宜過(guò)高；進(jìn)行壯苗培養(yǎng)時(shí)，生長(zhǎng)素的生物學(xué)效應(yīng)高于細(xì)胞分裂素，筆者的研究結(jié)果也證實(shí)了該結(jié)論。該研究中，增殖培養(yǎng)時(shí)高濃度的6-BA（1.0～2.0 mg/L）或6-BA和KT（各0.5 mg/L）分別與較低濃度的NAA（0.2 mg/L）組合均能誘導(dǎo)芽增殖，且獲得較高的增殖系數(shù)，6-BA與KT配合使用效果更佳；在壯苗培養(yǎng)時(shí)，稍高濃度的NAA（0.2 mg/L）與低濃度的6-BA（0.1 mg/L）組合能夠使長(zhǎng)勢(shì)較弱的叢生芽復(fù)壯。生長(zhǎng)素類型及使用濃度對(duì)組培生根效果影響顯著[7-8]。就冬紅而言，在該研究中NAA的促生根效果明顯優(yōu)于IBA，0.5 mg/L是其較合適的濃度。

該研究篩選獲得了冬紅離體培養(yǎng)的關(guān)鍵配方，在開(kāi)展冬紅組織培養(yǎng)時(shí)，要根據(jù)培養(yǎng)材料的具體情況，比如木質(zhì)化程度、苗內(nèi)生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑積累和繼代次數(shù)等，對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行相應(yīng)的優(yōu)化調(diào)整。該研究基本建立了冬紅組培快繁技術(shù)體系，為實(shí)現(xiàn)冬紅組培苗木批量化生產(chǎn)奠定了理論基礎(chǔ)。

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