昆明市呈貢區(qū)紅火蟻入侵情況調查及生物防治方法研究

王偉偉 單慧 張藝夕 劉晶 唐唯

摘要 對紅火蟻在呈貢區(qū)的入侵情況、形態(tài)特點及群體結構進行調查，并探索紅火蟻的生物防治方法。2017年第一次調查有蟻堆157個，第6次調查增加到340個，增長率達116.56%；形態(tài)學觀察及SSR基因多樣性檢測結果表明，呈貢區(qū)入侵紅火蟻為同一個種，群體結構較為單一；生物防治測定發(fā)現黃綠綠僵菌（Metarhizium flavoviride）和球孢白僵菌（Beauveria bassiana） 2個蟲生真菌均有防治效果，在106個/mL孢子濃度下紅火蟻致死率最高，處理第9天分別達50.7%和60.5%；2個真菌混合的孢子懸浮液，在106個/mL孢子濃度下，處理第9天的致死率達93.3%，致死中時（LT50=3.49）最短。

關鍵詞 紅火蟻；入侵；SSR；生物防治

中圖分類號 S433文獻標識碼 A文章編號 0517-6611（2018）31-0149-05

Abstract This study investigated the invasion situation， morphologic characters and population structure of RIFA in Chenggong District， and developed the biological control methods with two fungus.The first investigation showed that 157 ant nests were found in 2017， but 340 nests were detected by the 6th investigation in same year， up to 116.56% increasing rate.Meanwhile， the results of SSR test and morphology observation showed that the low population diversity with a singlespecies in Chenggong in 2017.Biological control test using both Metarhizium flavoviride and Beauveria bassiana showed the toxic effects to RIFA， and the more higher fatality rate under the 106 spores/mL concentrations at the 9th day was up to 50.7% and 60.5%， respectively.The result also found the highest fatality rate under the mixture with each 106 spores/mL concentrations at the 9th day was up to 93.3%， median lethal time（LT50） equal to 3.49.

Key words The red imported fire ant；Invasion；SSR；Biological control

紅火蟻（Solenopsis invicta，the red imported fire ant，RIFA）是一種原產于南美洲巴拉那河流域的害蟲，被列為世界上最危險的100種入侵有害生物之一[1]。紅火蟻在1986年傳入美國，2001年傳入澳洲大陸，2003年傳入我國臺灣地區(qū)，2004年底傳入我國大陸，在廣東吳川地區(qū)首次發(fā)現。我國于2005年1月將其列為入境檢疫害蟲[2]。目前，紅火蟻在我國南方地區(qū)9個省的傳播速度非常快[3-4]。

紅火蟻為完全地棲型蟻巢的螞蟻種類，成熟蟻巢是以土壤堆成蟻丘，有時為大面積蜂窩狀，內部結構呈蜂窩狀分布。新建的蟻丘表面土壤顆粒細碎、均勻，隨著蟻巢內蟻群數量不斷增加，露出土面的蟻丘也不斷增大[5]。紅火蟻具有2種社會模式[6]，因此，其繁殖速度非?？?。紅火蟻的入侵可極大地威脅地區(qū)的生物多樣性，還可使土壤內氮和磷含量顯著降低，嚴重影響植物的生長[7-8]。目前對紅火蟻的防治以化學藥劑為主，主要采用賜諾殺spinosyns、芬普fipronil、氟啶蟲胺腈sulfoxaflor、百利普芬pyriproxyfen藥劑[9-10]，一種或幾種溶解在食用油中，與餅干或面包屑混在一起作為誘餌來毒殺蟻巢中的蟻后。但化學方法也存在一定缺陷，一是南方濕潤多雨，誘餌在受潮后將部分或完全失效；二是化學藥劑將長期殘留在土壤深處，對生態(tài)環(huán)境造成持久影響。

生物防治是一項具有可持續(xù)性特點的防治手段，典型防治模式為蚤蠅，其具有強寄生性，目前被認為是紅火蟻的天敵，某些線蟲對蟻巢也有破壞作用[11]。此外，一些殺蟲真菌也被用來防治紅火蟻[12-13]。如用淡紫擬青霉（Paecilomyces lilacinus） 菌株處理紅火蟻15 d后，能殺死70.6%的工蟻[14]。研究表明，球孢白僵菌（Beauveria bassiana）和黃綠綠僵菌（Metarhizium flavoviride ）對紅火蟻均有較好的防治效果[15-16]；球孢白僵苗和黃綠綠僵苗是蟲生真菌，被認為是最有效的生物防治用真菌，其孢子和發(fā)酵液均能有效地防治紅火蟻[17-19]。目前關于昆明呈貢地區(qū)紅火蟻入侵群體結構和防治研究鮮見報道，同時，對2個生防蟲生真菌混用的效果，也缺乏相應的研究。

昆明氣候溫和、濕潤且多雨，適宜紅火蟻生存繁殖[20]。呈貢區(qū)為昆明新區(qū)，綠化建設時引入大量外來苗木，因此紅火蟻的入侵與外來苗木的帶入密切相關。2014年首次在云南師范大學呈貢校區(qū)發(fā)現紅火蟻，2015—2017年呈快速蔓延趨勢。筆者研究2017年紅火蟻入侵情況，對其分布和多樣性特點進行分析，探討球孢白僵菌和黃綠綠僵菌2種蟲生真菌對紅火蟻的生物防治效果。

1 材料與方法

1.1 調查地點及調查方法

紅火蟻主要分布于呈貢區(qū)各高校校園草坪土壤內，從2017年4月15日至6月30日共分6次（14 d/次）對6所高校（云南師范大學、昆明理工大學、云南大學、昆明醫(yī)科大學、云南民族大學、云南開放大學）校園內，直線距離間隔100 m以上的，單體面積大于10 m2人工草坪隨機選取各30個地塊進行調查，記錄蟻穴分布、發(fā)生率、蟻穴密度，動態(tài)監(jiān)測蟻穴的體積變化，局部破壞蟻丘后觀察蟻巢的內部結構。

1.2 采樣及形態(tài)學觀察

參考林立豐等[21]對紅火蟻形態(tài)特征及其鑒別方法的研究，分別取大小均一的工蟻置于150 mL滅菌錐形瓶中，用3%（M/V）乙醚密封處理90 s，待紅火蟻被麻醉后，在光學顯微鏡下（10×）觀察形態(tài)特征。

1.3 DNA提取

隨機采集6個不同地塊的紅火蟻20～30頭，參照昆蟲DNA提取試劑盒（Insect DNA Kit， OMEGA Inc.）說明書進行。提取的DNA置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 PCR擴增、毛細管電泳檢測

PCR擴增：2對PCR引物序列見表 引物由北京華大基因科技有限公司合成，擴增體系：2xTaq PCR Master mix 12.5 μL，模板DNA 10～15 ng，26BS、16BAS、24bS和25bAS[22]引物各1 μL或Solll-F、Solll-R [23-24]引物各1 μL，用ddH2O補至終體積25 μL。PCR反應在ABI 9700（Applied Biosystems）中進行。

26BS、16BAS、24bS和25bAS引物擴增程序：94 ℃預變性2 min；94 ℃變性15 s，55 ℃退火15 s，68 ℃延伸30 s，共35個循環(huán)；68 ℃延伸5 min，4 ℃終止反應。Solll-F和Solll-R引物擴增程序：92 ℃預變性2 min；92 ℃變性45 s，57 ℃退火45 s，72 ℃延伸60 s，共35個循環(huán)；72 ℃延伸5 min，4 ℃終止反應。

毛細管電泳分析于ABI 3500基因分析儀上進行，用ABI Data Collection軟件收集片段分析數據。

毛細管電泳掃描數據用軟件Gene Mapper v4.0分析?；蝾l率、遺傳多樣性系數用MVSP Ver 1.32軟件計算。

1.5 生防菌的分離及鑒定

2015年8月從昆明市呈貢區(qū)馬金鋪鎮(zhèn)葡萄園采集僵蠶體和土壤表面死亡的金龜子，直接挑取菌絲或孢子粉后接種在PDA培養(yǎng)基上，放于25 ℃恒溫箱中培養(yǎng)，經純化、形態(tài)學和ITS序列鑒定，最終得到一株球孢白僵菌（B.bassiana）和一株黃綠綠僵菌（M.flavoviride）。

1.6 生防效果測定 球孢白僵菌和黃是綠僵苗菌株都是蟲生真菌，均對紅火蟻有一定的致死性，因此用球孢白僵苗和黃是綠僵菌的孢子懸浮液和兩者混合的孢子懸浮液對紅火蟻進行毒性測定。

將球孢白僵苗和黃是綠僵菌菌株分別接種于PDA培養(yǎng)基上，在25 ℃、光照周期12 h/d（lx=2 000）的培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)14 d，待菌落產孢后，用0.05%Tween80溶液洗脫孢子在離心管內，振蕩后用雙層濾紙過濾，分別稀釋為終濃度104、105、106 個/mL的孢子懸浮液備用；同時，用球孢白僵苗和黃綠綠僵菌相同濃度的孢子懸浮液等體積混合成104、105、106 個/mL的混合液備用。

工蟻分別于2017年4月22日和5月8日隨機采集，置于滅菌的300 mL錐形瓶內，同時放入蟻穴周圍的新鮮土壤100 g、新鮮蘋果果肉40 g以及適量浸水棉球，在室溫條件下透氣濾紙密封放置48 h，待紅火蟻生存狀態(tài)趨于穩(wěn)定后，挑出大小相近的健康工蟻用于后續(xù)試驗。

以10頭工蟻為一組放入各濃度的孢子懸浮液中，浸泡10 s后取出，放入錐形瓶中繼續(xù)培養(yǎng)；空白對照組用無菌水代替真菌孢子懸浮液。每個濃度每個處理重復3次，從浸泡結束72 h后開始記錄死亡數，每48 h記錄一次，直至處理9 d為止。整個試驗重復2次。計算致死中時（LT50∶死亡率達到50%所需要的時間）。

2 結果與分析

2.1 紅火蟻入侵情況

2017年4—6月，紅火蟻的蟻穴數量增長較快（表2），在各校區(qū)各隨機選取3個蟻穴進行動態(tài)測量，2017年4月15日開始第1次，分別在4月29日、5月15日、5月29日、6月15日和6月29日共進行6次測量，結果發(fā)現不同地塊蟻穴大小隨時間增加呈持續(xù)增大趨勢（圖1）。

2.2 形態(tài)學觀察

紅火蟻工蟻蟲體銅棕色，腹部深棕色，體長3～6 mm，中軀與腹部間有2個明顯結節(jié)；頭部呈正方形或心形，觸角10節(jié)，大顎有4個明顯的小齒（圖2 A）；胸部有3對足（圖2 B、C）；腹柄分為2節(jié)，腹部末端有毒刺（圖2 D）；卵未觀察到，蛹呈白色，蟲體柔軟，不能移動（圖2 E），蟻穴明顯隆起形成土丘（圖2 F）。

2.3 毛細管電泳及分析

毛細管電泳分析發(fā)現2對引物共擴增出4個等位基因位點，其中2個多態(tài)性等位基因位點。6個不同采集地的紅火蟻群體遺傳相似性系數為0.857，紅火蟻群體遺傳距離在0.143～0.227。這表明各校園內紅火蟻群體具有一定的多樣性，但群體結構間差異較?。ū?、圖3）。

2.4 生防菌的防治效果

分別用不同濃度的球孢白僵菌和黃綠綠僵菌孢子懸浮液處理紅火蟻并觀察其防治效果，結果表明，2個菌株均在106個/mL時對紅火蟻的致死率最高，第9天時致死率分別為50.7%、60.5%，對照組為16.7%（表4， 圖4 A、B）；在該濃度下黃綠綠僵菌 （LT50 = 9.06）、球孢白僵菌（LT50=7.20）均遠小于對照組（LT50 = 30.61）。在低濃度處理下（104個/mL）黃綠綠僵菌（LT50=16.07）大于球孢白僵菌（LT50=13.36），在中濃度處理下（105個/mL）球孢白僵菌（LT50=10.31）小于黃綠綠僵菌（LT50=19.00）。2個菌株孢子懸浮液的混合試驗結果表明，106個/mL孢子濃度對紅火蟻的致死率最高，第3、5、7、9天死率均顯著高于相同時間下2個菌株的單獨處理（P<0.05），第9天的致死率達93.3%，致死中時LT50=3.49；在中濃度105個/mL和低濃度104個/mL處理下，致死中時LT50分別為5.69和8.07（圖4 C）。

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