安徽石蒜組培快繁體系的建立

姜自紅

摘要 [目的]建立安徽石蒜組織培養(yǎng)體系。[方法]將直徑3～4 cm的鱗莖切成數(shù)塊帶鱗莖盤(pán)的雙鱗片作為外植體，通過(guò)消毒、誘導(dǎo)生芽、增殖、生根過(guò)程建立組織培養(yǎng)體系。[結(jié)果]鱗莖外植體用0.1%氯化汞溶液進(jìn)行二次滅菌后接種效果最好。最適宜的芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+6-BA 3 mg/L+NAA 0.5 mg/L+白糖 30 g/L，最適增殖培養(yǎng)基為MS+6-BA 3 mg/L+NAA 0.5 mg/L+白糖30 g/L，最適生根培養(yǎng)基為1/2MS+NAA 0.5 mg/L+白糖30 g/L，生根小鱗莖在泥炭∶蛭石=7∶3的介質(zhì)中成活率達(dá)93.3%。[結(jié)論]該研究可為提供大量的安徽石蒜組培苗提供技術(shù)基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 安徽石蒜；鱗莖；組織培養(yǎng)

中圖分類(lèi)號(hào) S604+.3文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A文章編號(hào) 0517-6611（2018）31-0085-03

Abstract [Objective]To establish a tissue culture system of Lycoris anhuiensis. [Method]The bulbs with a diameter of 3-4 cm were cut into several scales with bulbs as explants， and the tissue culture system was established by disinfection， induction of sprouting， proliferation and rooting. [Result]Bulb explants were best inoculated with 0.1% mercuric chloride solution after secondary sterilization. The most suitable bud induction medium was MS+6BA 3 mg/L + NAA 0.5 mg/L + white sugar 30 g/L. The optimal proliferation medium was MS+6BA 3 mg/L+ NAA 0.5 mg /L + white sugar 30 g/L， the most suitable medium for rooting was 1/2MS + NAA 0.5 mg/L + white sugar 30 g/L. The domesticated seedlings had a survival rate of 93.3% in a medium with peat∶vermiculite=7∶3. [Conclusion]The research could provide a technical basis for providing a large number of L. anhuiensis tissue culture seedlings.

Key words Lycoris anhuiensis；Bulb；Tissue culture

石蒜屬（Lycoris Herb）隸屬石蒜科（Amaryllidaceae），具有豐富的花型[1]，如大花型和小花型；皺瓣、平瓣、寬瓣和窄瓣；百合型和長(zhǎng)筒型等，花后冬春季又可觀葉，有著極高的觀賞價(jià)值[2]，很早以前就受到人們的喜愛(ài)，目前石蒜、乳白石蒜、忽地笑、愛(ài)斯石蒜、香石蒜等11種已實(shí)現(xiàn)商品化生產(chǎn)[3]。李淑順等[4]以灰色關(guān)聯(lián)度對(duì)14種石蒜屬花卉的觀賞性狀進(jìn)行了評(píng)價(jià)，結(jié)果表明安徽石蒜（Lycoris anhuiensis）排在第 觀賞效果好。但目前安徽石蒜多處于野生狀態(tài)[5]，資源稀缺，以自然分球法繁殖的繁殖速度慢，繁殖系數(shù)相當(dāng)?shù)?；種子難以正常成熟，自然結(jié)實(shí)率不高[6]，種子成熟度差，限制了其在園林中的推廣應(yīng)用，解決種球快速繁殖問(wèn)題是安徽石蒜產(chǎn)業(yè)化開(kāi)發(fā)的關(guān)鍵[7]。筆者以鱗莖為外植體，對(duì)安徽石蒜的組培快繁技術(shù)進(jìn)行了研究。

1 材料與方法

1.1 材料

安徽石蒜鱗莖，取材于安徽瑯琊山。

1.2 方法

1.2.1 不同預(yù)處理及消毒方法對(duì)石蒜鱗莖外植體成活率的影響。選取生長(zhǎng)健壯、直徑3～4 cm、大小基本一致的鱗莖，剝除外層褐色皮膜，在流水下沖洗 1～2 h，將沖洗干凈的鱗莖切去頂端。

預(yù)處理方法：選取冷藏0（對(duì)照）、7、21、35、49 d處理方式。

消毒方法：先用0.1%氯化汞消毒10 min，再根據(jù)切球后是否進(jìn)行0.1%氯化汞二次消毒1 min設(shè)置2種處理，接種21 d后記錄每種處理的接種數(shù)及污染數(shù)。接種培養(yǎng)基為MS+6-BA 5.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L+白糖30 g/L。

1.2.2 不同激素及濃度配比對(duì)不定芽誘導(dǎo)的影響。將經(jīng)預(yù)處理后的安徽石蒜鱗莖切成帶基盤(pán)的雙層或三層鱗片，消毒后接種在MS培養(yǎng)基上，對(duì)不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑 6-BA 和 NAA 的不同濃度配比進(jìn)行篩選。每個(gè)處理接種10個(gè)外植體，重復(fù)3次，將鱗片接種后，每隔3 d觀察1次，50 d后統(tǒng)計(jì)不定芽誘導(dǎo)率，不定芽誘導(dǎo)率=分化不定芽的外植體數(shù)/接種的外植體數(shù)×100%。

1.2.3 不同激素及濃度配比對(duì)小鱗莖擴(kuò)繁增殖的影響。經(jīng)過(guò)初代培養(yǎng)，以篩選出的最佳培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，對(duì)6-BA、NAA、 4-D進(jìn)行不同濃度組合試驗(yàn)，35 d后分別記錄每組處理小鱗莖的增殖情況。重復(fù)3次，以篩選出最佳增殖培養(yǎng)基，增殖倍數(shù)=誘導(dǎo)不定芽總數(shù)/接種不定芽總數(shù)。

1.2.4 不同培養(yǎng)基對(duì)小鱗莖生根的影響。將長(zhǎng)勢(shì)較好的小鱗莖轉(zhuǎn)入含不同激素及濃度的生根培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng)，對(duì)小鱗莖的最佳生根條件進(jìn)行研究。

1.2.5 不同土壤條件對(duì)生根苗移栽成活率的影響。按朱景存等[8]的方法，將經(jīng)過(guò)處理的生根幼苗分別移植于營(yíng)養(yǎng)土和摻蛭石10%、30%、50%、70%的營(yíng)養(yǎng)土中，每個(gè)處理5盆，每盆3株，常規(guī)管理，30 d后統(tǒng)計(jì)成活率，成活率=成活數(shù)/馴化株數(shù)×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 鱗莖不同預(yù)處理方法比較

有研究認(rèn)為石蒜鱗莖為內(nèi)生菌[9]，徹底滅菌較為困難，試驗(yàn)設(shè)計(jì)了預(yù)處理及二次滅菌。從表1可以看出，石蒜鱗莖經(jīng)過(guò)預(yù)處理后，明顯降低了污染率，尤其是經(jīng)二次消毒后，污染率為0，效果非常顯著，但同時(shí)也出現(xiàn)了外植體干褐的現(xiàn)象。該試驗(yàn)鱗莖球冷藏效果比較好的是冷藏21 d的處理。綜合分析得出石蒜鱗莖的最佳滅菌方式為冷藏21 d后，用0.1%氯化汞溶液處理10 min，無(wú)菌水沖洗4～5次，切成雙鱗片后再用0.1%氯化汞溶液處理1 min，無(wú)菌水沖洗4～5次。

2.2 不同濃度組合對(duì)雙鱗片出芽影響的雙因素試驗(yàn)

將雙鱗片接種到A1～A8培養(yǎng)基中，發(fā)現(xiàn)鱗片于28 d開(kāi)始出現(xiàn)向內(nèi)側(cè)卷曲發(fā)綠的情況（圖1）。不同部位的外植體，其卷曲程度亦有所差別，隨后長(zhǎng)出白色的生長(zhǎng)點(diǎn)，側(cè)芽由白變綠（圖2），誘導(dǎo)過(guò)程中沒(méi)有愈傷組織出現(xiàn)。由表2可知，雙鱗片外植體的誘導(dǎo)率總體偏低，最高A4培養(yǎng)基中也僅33.3%，其中A1培養(yǎng)基的不定芽誘導(dǎo)率最低，其長(zhǎng)出的側(cè)芽量也最少，不定芽長(zhǎng)勢(shì)最差，其次是A2和A3培養(yǎng)基。因此，MS+6-BA 30 mg/L+NAA 0.5 mg/L+白糖30 g/L為不定芽誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基。

2.3 鱗莖不定芽的增殖情況

將誘導(dǎo)形成的帶不定芽的石蒜鱗莖切割轉(zhuǎn)至增殖培養(yǎng)基，經(jīng)觀察發(fā)現(xiàn)，20 d后各培養(yǎng)基上乳白色的不定芽陸續(xù)開(kāi)始形成，同時(shí)，部分雙鱗片間還有石蒜葉長(zhǎng)出（圖3）。由表3可知，增殖倍數(shù)均較低，其中B1和B3培養(yǎng)基的平均增殖倍數(shù)最低，其芽的長(zhǎng)勢(shì)也較差，增殖倍數(shù)相對(duì)最高的是B6培養(yǎng)基，其增殖倍數(shù)為1.83。確定B6培養(yǎng)基為最優(yōu)不定芽增殖培養(yǎng)基，即MS+6-BA 3 mg/L+NAA 1.0 mg/L+白糖30 g/L。

2.4 不同培養(yǎng)基對(duì)小鱗莖生根的影響

從表4可以看出，C6培養(yǎng)基即1/2MS+NAA 2.0 mg/L+白糖30 g/L為最佳生根培養(yǎng)基。在一定濃度范圍內(nèi)，不定根的誘導(dǎo)率會(huì)隨著NAA含量的增加而增加，且不定根的長(zhǎng)勢(shì)也較好。

2.5 煉苗與移栽 石蒜屬植物多耐旱、耐貧瘠、易管理[10]，馴化時(shí)保持基質(zhì)濕潤(rùn)即可。一般移入基質(zhì)中幾天后，外層葉片會(huì)逐漸變黃、枯萎，呈現(xiàn)出與休眠期葉片變化相似的現(xiàn)象，同時(shí)從鱗莖中心處又抽出新的葉子。馴化30 d后記錄的成活結(jié)果見(jiàn)表5，經(jīng)過(guò)煉苗的組培苗移栽后最高成活率為933%。

3 結(jié)論與討論

此次研究完成了安徽石蒜植物組培體系的構(gòu)建，鱗莖球冷藏處理可以降低污染率，其中21 d冷藏污染率低。最適合的消毒方法為0.1%氯化汞消毒10 min，無(wú)菌水沖洗4～5次，鱗片處理好后再用0.1%氯化汞處理1 min，無(wú)菌水沖洗4～5次。初代培養(yǎng)中，最佳誘導(dǎo)不定芽的培養(yǎng)基為MS+6-BA 3 mg/L+NAA 0.5 mg/L+白糖30 g/L，卡拉膠 5.5 g/L，pH 58，與劉志高等[11]研究報(bào)道的乳白石蒜帶基盤(pán)雙鱗片誘導(dǎo)不定芽的最佳培養(yǎng)基一致。繼代培養(yǎng)中，不定芽增殖倍數(shù)最高的培養(yǎng)基為MS+6-BA 3 mg/L+NAA 1.0 mg/L+白糖30 g/L，卡拉膠5.5 g/L，pH 5.8；最佳生根培養(yǎng)基為1/2MS +NAA 2 mg/L+白糖30 g/L，卡拉膠5.5 g/L，pH5.8。出瓶苗在泥炭∶蛭石=7∶3的介質(zhì)中成活率達(dá)93.3%。在鱗莖不定芽誘導(dǎo)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，較高的6-BA含量有利于促進(jìn)不定芽的形成，6-BA含量超過(guò)3 mg/L后啟動(dòng)較容易。該研究為安徽石蒜組培苗規(guī)?；?、工廠化生產(chǎn)提供了理論依據(jù)和基礎(chǔ)數(shù)據(jù)支撐。

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