降解上部煙葉大分子物質的復合酶配制與條件優(yōu)化

沙云菲 董惠忠 張耀 馬開玥 張薄博 許贛榮 陳磊

摘要：為降低上部煙葉中淀粉和蛋白質等大分子成分含量，提高其吸食品質，本研究在統(tǒng)一評價酶活力的基礎上，選用4種酶制劑（淀粉酶IV.蛋白酶I、果膠酶I和纖維索酶II）配制復合酶制劑，采用單因素法和Box-Benhnken響應面分析法對影響酶解效果的復合酶量、緩沖液pH、含水量和酶解時間等因素進行優(yōu)化。分析顯示，4個因素對上部煙葉中淀粉和蛋白質降解率的影響順序為：緩沖液pH>酶解時間>含水量>復合酶量。響應面分析結果確定最優(yōu)酶解條件為：復合酶量1.1單位（即淀粉酶Ⅳ33U/g煙葉，蛋白酶I 550U/g煙葉，果膠酶1220U/g煙葉，纖維索酶II220U/g煙葉）、緩沖液pH 7.7、含水量54%、酶解時間5.5 h，此時淀粉和蛋白質降解率分別為19.54%和20.03%。本研究中的復合酶制劑及酶解條件可以很好地結合于煙草打葉復烤工藝過程中，具有較好的應用前景。

關鍵詞：復合酶：上部煙葉：淀粉：蛋白質：響應面法

烤煙的上部煙葉包括上二棚葉和頂葉，共6～7片，占整株煙葉總產(chǎn)量的30%-40%。上部煙葉葉片較厚，組織結構較緊密，淀粉、蛋白質等大分子成分含量過高，燃燒后具有煙氣濃度和勁頭大、刺激性大、雜氣重等缺點，工業(yè)可用性較差。

近年來的研究中，改善上部煙葉吸食品質的方法主要有3種：生物酶法、化學添加法、微生物發(fā)酵法。其中，生物酶法因為條件溫和、易于操作、改善效果明顯，在實際應用中具有一定優(yōu)勢。外加復合酶在較溫和的條件下，將淀粉、蛋白質以及果膠、纖維素（細胞壁物質）等大分子物質分解成低聚糖、半乳糖醛酸、還原糖、短肽和氨基酸等以減少煙草原料的刺激性和雜氣，改善吸食品質，提高其在煙草行業(yè)中的使用價值。然而，由于不同來源的市售酶制劑酶活單位定義不同，無法比較不同來源酶制劑的作用效果，導致實驗得出的酶制劑使用量和配方無法重現(xiàn)。因此，雖然已有較多酶法改善上部煙葉品質的研究，但實際應用較少。

本研究選擇4類生物酶（淀粉酶、蛋白酶、果膠酶和纖維素酶），在對其進行統(tǒng)一酶活評價的基礎上，以淀粉降解率和蛋白質降解率為評價指標，采用單因素法和響應面法對復合酶量、酶解條件進行優(yōu)化，以縮短酶解時間，與現(xiàn)代煙草加工工藝相協(xié)調，使上部煙葉中淀粉和蛋白質的含量降低，同時增加水溶性糖分及氨基酸，使上部煙葉中各化學成分比例相對協(xié)調，從而改善上部煙葉的雜氣、勁頭和刺激性，為提高上部煙葉品質奠定理論基礎。

1材料與方法

1.1試驗材料

上部煙葉B2F：上海煙草集團有限責任公司提供，2014年產(chǎn)于貴州，煙葉經(jīng)切絲后用于酶解。鹽酸、氫氧化鈉、無水乙醇、濃硫酸等，AR：酪蛋白、果膠、淀粉：半乳糖醛酸標品。以上試劑均由中國國藥集團化學有限公司生產(chǎn)。

淀粉酶I，中溫淀粉酶BAN 0.8L（諾維信Novozymes生物技術有限公司）：淀粉酶II，高溫淀粉酶（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）：淀粉酶III，高溫淀粉酶（上海麥克林生化科技有限公司）：淀粉酶IV，低溫淀粉酶（江蘇銳陽生物科技有限公司）。蛋白酶I，中性蛋白酶0.8 L（諾維信Novozymes生物技術有限公司）：蛋白酶II，水解蛋白酶2.4 L（諾維信Novozymes生物技術有限公司）：蛋白酶III，中性蛋白酶（北京索萊寶科技有限公司）。果膠酶I，上海源葉生物科技有限公司：果膠酶II，江蘇銳陽生物科技有限公司。纖維素酶I，上海麥克林生化科技有限公司：纖維素酶II，江蘇銳陽生物科技有限公司。

1.2儀器與設備

H2-2型電熱恒溫振蕩水浴箱，上海精宏實驗設備有限公司：TGL-16M型臺式高速離心機，湖南賽特湘儀離心機儀器有限公司：Enspire 2300多標記檢測系統(tǒng)（酶標儀），美國PerkinElmer公司UV3000型紫外一可見光分光光度計，日本Himchi公司：MB45紅外水分測定儀，美國OHAUS儀器有限公司：FA1004型電子天平，上海舜宇恒平科學儀器有限公司：SKD-200凱氏定氮儀，上海沛歐分析儀器有限公司；SKD-0892紅外智能消化爐，上海沛歐分析儀器有限公司。

1.3測定方法

1.3.1原料預處理

陳化后的上部煙葉經(jīng)松散回潮、切絲、烘絲后，制得試驗用長度均勻的煙絲（水分約12.5%，以紅外水分測定儀測得）。

1.3.2煙絲的酶解精確稱取（25.00±0.02）g煙絲置于篩網(wǎng)，于65℃水浴箱中保溫回潮20 min，使煙絲水分含量約21%。將回潮結束的煙絲平鋪于干凈的20 cmx16 cm陶瓷托盤，按照一定料水比將酶液（pH 7.5磷酸緩沖液溶解并稀釋）均勻噴灑在煙絲上，噴灑過程中常翻動煙絲使酶液混合均勻，以食品級密封袋密封好，于適當溫度恒溫箱中酶解。酶解結束后，采用烘箱快速烘干至水分含量12.0%-12.5%，待測。

1.3.3復合酶制劑配方中酶種類的選擇在30～70℃范圍內測試各種酶的活性變化，初步確定適合于多種酶類進行反應的溫度，以及在此溫度下活性較高的商品酶（淀粉酶、蛋白酶、果膠酶和纖維素酶各1種）作為酶制劑的配方用酶，同時對酶的活性進行統(tǒng)一評價。根據(jù)所確定的酶解溫度和酶種類，將1mL一定濃度的淀粉酶、果膠酶、纖維素酶分別與蛋白酶混合，在40℃下反應30 min，迅速將混合體系置于冷水中冷卻，再測定各種酶的活性。以不添加蛋白酶的體系為對照，確定蛋白酶對其他酶活性的影響。

1.3.4單位復合酶制劑中各種酶添加量的確定以不同濃度的淀粉酶（2、5、10、30、50 U/g煙葉）、蛋白酶（100、250、500、1000、2000 U/g煙葉）、果膠酶（50、100、200、500、1000 U/g煙葉）、纖維索酶（50、100、150、200、300 U/g煙葉）分別以料水比20：1加料于煙絲，密封后于40℃恒溫酶解30 min，按1.3.2所述烘干至水分含量12.0%-12.5%，測定各樣品中相應成分含量，根據(jù)結果確定單位復合酶中各種酶的添加量。

1.3.5

復合酶處理上部煙葉單因素實驗

根據(jù)1.3.4的試驗結果選定復合酶配比，分別考察復合酶量（0.1、0.5、1、1.5、2單位）、緩沖液pH（5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0）、含水量（20%、30%、40%、50%、60%、80%）、酶解時間（0.5、1、2、4、6、8、10 h）對酶解效果的影響。

1.3.6響應面優(yōu)化酶解煙葉樣品條件

使用軟件Design Expert 10.0.3中的Box-Behnken（BBD）中心組合設計響應面分析，設置以下4個因素復合酶用量（A）、緩沖液pH（B）、含水量（C）、酶解時間（D）1研究環(huán)境對酶解上部煙葉效果的影響。實驗設計4因素3水平，響應面分析及因素如表1，每個實驗重復3次。

1.3.7主要化學成分檢測方法還原糖、可溶性總糖及淀粉含量的測定參照文獻，蛋白含量測定參照GB 5009.5-2016方法，果膠含量的測定參照YC/T 346-2010方法，纖維素含量的測定參照范式（Van Soest）酸性洗滌纖維分析法。

1.4數(shù)據(jù)處理

所有試驗均重復3次（n=3），試驗數(shù)據(jù)采用Origin 7.0和Excel 2016軟件進行統(tǒng)計分析和作圖。

2結果

2.1酶制劑中適宜商品酶種類及酶解溫度

如圖1A所示，在40℃左右的環(huán)境下低溫淀粉酶（淀粉酶Ⅳ）的酶活性高于其他淀粉酶。圖1B示出，諾維信中性蛋白酶0.8 L（蛋白酶I）在45℃時活性相對于其他兩種蛋白酶制劑更高。果膠酶和纖維素酶的最大酶活均出現(xiàn)在40-50℃溫度范圍（圖1C，1D），而果膠酶I和纖維素酶II酶活更高。

綜合以上結果，在進行復合酶處理上部煙葉實驗中用于配制復合酶的各種酶制劑選定為：淀粉酶Ⅳ、蛋白酶I、果膠酶I、纖維素酶II。酶解溫度選擇40℃進行下一步試驗。

經(jīng)30min蛋白酶I酶解處理后，在pH 7.5，40℃下各種酶活性如表2所示。與未經(jīng)蛋白酶處理的酶活性相比，分別添加蛋白酶I后對這些酶活性沒有顯著影響，說明蛋白酶對各種酶活性影響不大。因此在配制復合酶的過程中，蛋白酶I可以與3種酶制劑復配使用。由于其他三者均是針對專一性底物，相互間并無協(xié)同作用效果，因此，復合酶制劑中各類酶量配比可以由各種酶的單因素試驗確定。

2.2單位復合酶制劑中的各種酶量配比

如表3所示，40℃下，當?shù)矸勖柑砑恿繛?0 U/g時淀粉的降解效果最好。當?shù)鞍酌柑砑恿窟_到500 U/g時，蛋白的降解率趨于穩(wěn)定，繼續(xù)增大蛋白酶添加量對于蛋白質降解率影響不大。當果膠酶和纖維素酶添加量均達到200 U/g后，相應成分的降解率趨于穩(wěn)定，繼續(xù)增大酶添加量對于降解率影響不顯著。因此復合酶中單一酶的添加量依次為：淀粉酶Ⅳ30U/g煙葉，蛋白酶I 500U/g煙葉，果膠酶I 200U/g煙葉，纖維素酶II 200U/g煙葉，用指定pH的緩沖液將各酶制劑配制為復合酶液，定義為復合酶1單位。

2.3復合酶制劑處理上部煙葉的單因素試驗結果

如圖2A所示，隨復合酶量的增加，淀粉降解率呈逐步升高趨勢，在復合酶量為1時趨于穩(wěn)定。蛋白質和淀粉的降解率（圖2B）在pH 5-8范圍內隨pH升高而升高，在pH 8-9時達到最高值。這可能與煙葉本身pH偏酸性（pH-5.5）有關，略高的pH起到了中和作用使最終pH維持在適合生物酶作用的范圍。

隨含水量增加（圖2C），上部煙葉中淀粉和蛋白的降解率呈升高趨勢。在水分含量達到60%時，煙葉中淀粉和蛋白的降解率趨于穩(wěn)定。隨酶解時間的延長（圖2D），淀粉和蛋白降解率都呈增加趨勢，淀粉降解率在6 h后逐步趨于穩(wěn)定，而蛋白降解率在4h后即趨于穩(wěn)定。

以上結果表明，反應溫度40℃條件下，煙葉中淀粉和蛋白質的最優(yōu)酶解條件為：復合酶添加量1（淀粉酶Ⅳ30U/g煙葉，蛋白酶I 500U/g煙葉，果膠酶I 200U/g煙葉，纖維素酶11200U/g煙葉），緩沖液pH 8，煙葉含水量60%，酶解時間6h。

2.4響應面試驗

2.4.1響應面設計及結果在單因素實驗基礎上，使用軟件Design Expert 10.0.3中的Box-Behnken（BBD）中心組合設計響應面分析，分別以淀粉降解率和蛋白質降解率為響應值，取復合酶量（A）、緩沖液pH（B）、含水量（C）、酶解時間（D）為因素設計4因素3水平的響應面分析試驗，試驗設計與結果見表4。

2.4.2淀粉降解率模型的建立及其顯著性檢驗采用Design-Expert軟件對試驗結果進行響應面回歸分析，得到淀粉降解率對所選4個因素（即復合酶添加量、pH、含水量、酶解時間）的二次多項回歸方程為：淀粉降解率/%=19.46+0.73A+1.18B+0.75C+0.99D-0.43AB-0.69AC+0.36AD-1.17BC-0.60BD+1.26CD-2.93A2-4.4482-2.82C2-3.43D。

由表5方差分析結果和圖3目標函數(shù)的響應曲面圖可以看出，各因素對淀粉降解率的影響順序為：緩沖液pH>酶解時間>含水量>復合酶量，且緩沖液pH與含水量、含水量與酶解時間的交互作用顯著（P<0.05）。

2.4.3蛋白質降解率模型的建立及其顯著性檢驗采用軟件對響應面結果進行回歸分析，得到蛋白質降解率對所選4個因素的二次多項回歸方程為：

由圖4和表6可知，各因素對蛋白質降解率的影響順序為：緩沖液pH>酶解時間>含水量>復合酶量，與淀粉降解率中的影響一致，而且緩沖液pH與含水量、緩沖液oH與酶解時間的交互作用顯著（p<0.05），復合酶量與含水量、復合酶量與酶解時間、含水量與酶解時間的交互作用極顯著（p<0.0001）。

2.4.4酶解條件的優(yōu)化與驗證

由表5和表6可知，兩個模型的p值均小于0.0001，失擬項p>0.05，表明失擬不顯著，且回歸模型與實際實驗擬合程度較好，實驗方法可靠。模型的確定系數(shù)R2和校正確定系數(shù)R2adi均大于0.9，且兩組值分別接近，表明模型預測值與實際實驗結果具有良好的相關性。兩個模型預測殘差平方和均大于10，說明兩個模型解釋變差的能力較強，總體擬合具有統(tǒng)計學意義，可分別用來預測復合酶對上部煙葉中的淀粉和蛋白質降解率。

根據(jù)Design Expert 10.0.3軟件中0ptimization的Numerical功能，在模型濃度范圍內選擇最低點為出發(fā)點，使用最大值優(yōu)化，得到復合酶酶解上部煙葉淀粉和蛋白質的理論最佳條件（表7），在最佳理論條件下淀粉和蛋白質降解率的預測值分別為為19.69%和20.19%。

由表7亦可知，淀粉和蛋白質降解率最佳理論條件中各參數(shù)數(shù)值接近，考慮到實際實驗條件的便利，為同時能達到兩者的最高降解率，在40℃條件下，選擇復合酶量1.1、pH 7.7、含水量54%、酶解時間5.5 h，取3次平行試驗結果的平均值，進行驗證試驗和和重復性考察。如表8所示，試驗測得淀粉降解率為19.54%，蛋白質降解率為20.03%，相對誤差分別為0.76%和0.79%，試驗值與預測值基本一致，說明該條件的優(yōu)化結果具有較高準確率。該酶解條件下，果膠和纖維素等成分均有不同程度的降解，還原糖和可溶性總糖含量顯著增加。對最優(yōu)酶處理條件下所得煙絲樣品進行感官評吸（表9），結果顯示，酶處理后的煙絲比未處理的煙絲樣品在雜氣、勁頭和刺激性等方面都有一定改善?？梢?，以響應面法優(yōu)化后的酶解條件處理上部煙葉后，蛋白質、淀粉等主要大分子成分含量顯著降低，同時還原糖、可溶性總糖含量及施木克值顯著提高，上部煙葉中各化學成分的協(xié)調性得到了明顯提升，對于提高上部煙葉品質具有一定的意義。

3討論

上部煙葉中含量較高的大分子成分對其品質影響較大。淀粉含量較高時，會影響燃燒速度，使燃燒不完全，產(chǎn)生糊焦味。蛋白質含量高，在燃燒時會產(chǎn)生不良氣味，并提高煙氣pH值而增加煙氣勁頭和刺激性。纖維素有燒紙味：果膠有木質氣，雜氣重、余味差、對口腔刺激性大，會改變煙氣狀態(tài)。此外在調制后的煙葉中，蛋白質、淀粉會與纖維索、果膠質等共存，且不易分離。而預試驗結果表明，加入果膠酶和纖維素酶可以大大增強蛋白酶、淀粉酶的降解效率。故將蛋白酶、淀粉酶與細胞壁降解酶（果膠酶、纖維素酶）結合使用，果膠酶和纖維素酶的作用為適度降解煙葉細胞壁，使淀粉酶和蛋白酶可以更為充分地起到降解作用。

文中酶解后煙葉中的還原糖、可溶性總糖含量的提高幅度高于淀粉、果膠、蛋白質及纖維素的降解量，可能由于酶制劑在酶解過程中不僅作用于淀粉、果膠、纖維素等不溶性大分子成分，還會作用于其他多聚體或低聚體成分，其機理有待于進一步研究。

本研究中經(jīng)優(yōu)化后的酶解最佳水分含量為54%（含煙葉本身12.5%的水分），在該水分條件下進行煙絲噴灑試驗，通過對比酶處理前后的評吸效果，不會造成煙絲香味物質的損失。本研究所得復合酶制劑處理上部煙葉的酶解條件可用于打葉復烤階段，在打葉去梗及篩分之后的加料配葉過程利用現(xiàn)有加料設備進行復合酶液的噴灑，并增加儲葉過程，在所優(yōu)化的條件下進行酶解處理，以降低上部煙葉中的淀粉和蛋白質含量，無須額外增加大規(guī)模的生產(chǎn)處理設備。在之后的煙片復烤階段，經(jīng)90℃左右復烤使煙葉中水分降低至12.5%左右，并將所添加的復合酶變性失活，可避免其在下一步的裝箱醇化過程中對煙葉品質繼續(xù)產(chǎn)生影響。因此，本研究所述復合酶的添加及作用條件可以很好的結合于煙草的生產(chǎn)工藝過程中，具有較好的應用前景。

本文所采用的響應面分析法利用合理的試驗設計進行實驗得到數(shù)據(jù)，采用多元二次回歸方程來擬合因素與響應值之間的函數(shù)關系，并通過對回歸方程的分析來尋求最優(yōu)工藝參數(shù)，以解決多變量問題，對于實驗結果的得出具有非常重要的意義。由于復合酶和上部煙葉都是復合體系，底物和酶的種類較多，因此無法進行簡單的酶動力學分析，今后需考慮建立復雜的數(shù)學模型，對復合酶降解煙葉中大分子成分的動力學展開更為深入的探討。

4結論

本研究在統(tǒng)一酶活評價的基礎上，通過單因素試驗和Box-Behnken響應面設計，得出降解上部煙葉中淀粉和蛋白質的最佳條件為：復合酶量配比為：淀粉酶Ⅳ33u/g煙葉、蛋白酶I 550U/g煙葉、果膠酶I 220U/g煙葉、纖維素酶11220U/g煙葉，pH7.7、含水量54%、酶解時間5.5 h。此時淀粉和蛋白質降解率分別為19.54%和20.03%，實驗值與預測值基本一致，該酶解條件的優(yōu)化結果具有較高準確率和可靠性。酶處理后，煙葉的雜氣、勁頭和刺激性明顯改善。上述研究成果為上部煙葉的品質提升奠定了基礎。