淺談核酸檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室防污染措施

薛秀榮 來祝檁 韓惠云

[摘要] 血站開展核酸檢測(cè)是保證血液安全的重要舉措。氣溶膠污染是核酸檢測(cè)過程中最主要且最常見污染，也是困擾絕大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室的一個(gè)難題，如果不加以重視，氣溶膠會(huì)污染整個(gè)實(shí)驗(yàn)室，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)室不能正常運(yùn)行。該文在核酸檢測(cè)防污染方面進(jìn)行初步總結(jié)。

[關(guān)鍵詞] 防污措施；核酸檢測(cè)；氣溶膠污染

[中圖分類號(hào)] R331 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1672-5654（2018）09（b）-0144-02

到2015年，血液核酸篩查檢測(cè)基本覆蓋全國[1]。核酸檢測(cè)反應(yīng)的最大特點(diǎn)是具有較大擴(kuò)增能力與極高的靈敏性，但在操作過程中易受到污染，極其微量的污染即可造成假陽性的產(chǎn)生。該站核酸實(shí)驗(yàn)室運(yùn)行至今已完成了將近27萬人次的核酸樣本檢測(cè)，在核酸檢測(cè)防污染方面積累了一定的工作經(jīng)驗(yàn)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 布局合理的實(shí)驗(yàn)室是保證實(shí)驗(yàn)?zāi)苷＿M(jìn)行的前提

該站核酸實(shí)驗(yàn)室按工作需要分為：試劑儲(chǔ)存區(qū)（一區(qū)）、樣本處理區(qū)（二區(qū)）、擴(kuò)增區(qū)（三區(qū)），各區(qū)均設(shè)有緩沖間。各區(qū)在空間上完全獨(dú)立，不能相通。各區(qū)有獨(dú)立的通風(fēng)系統(tǒng)，一、二、三區(qū)壓力依次遞減，一區(qū)、二區(qū)保持正壓，三區(qū)保持負(fù)壓狀態(tài)，各區(qū)間壓差≥5 Pa，二區(qū)、三區(qū)可適當(dāng)加大壓差。進(jìn)風(fēng)口和出風(fēng)口不能設(shè)在建筑的同一平面，要避免排出的空氣被重新吸進(jìn)實(shí)驗(yàn)室。各區(qū)域只用于特定的操作，工作衣和清潔消毒物品不得跨區(qū)混用，實(shí)驗(yàn)室人員和物品應(yīng)按照從一區(qū)→二區(qū)→三區(qū)的單向工作流向制度，不得逆向流動(dòng)。

2 質(zhì)量控制

實(shí)驗(yàn)室應(yīng)建立合理、科學(xué)的室內(nèi)質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程（SOP），根據(jù)檢測(cè)模式的不同選擇不同的質(zhì)控方法和質(zhì)控規(guī)則，且質(zhì)控應(yīng)從樣本處理到報(bào)告發(fā)放全程參與，對(duì)每一批檢測(cè)至少設(shè)立一組質(zhì)控品，并包括至少一個(gè)弱陽性室內(nèi)質(zhì)控品。

2.1 人員和培訓(xùn)

真正決定工作質(zhì)量的關(guān)鍵是人。防污染的關(guān)鍵是工作人員安全的操作行為和嚴(yán)格執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程。實(shí)驗(yàn)室人員配備應(yīng)該符合核酸檢測(cè)工作量的要求，崗位設(shè)置與選擇的檢測(cè)系統(tǒng)和檢測(cè)策略配合一直，工作人員需要通過相關(guān)的質(zhì)量管理規(guī)范要求，定期參加核酸檢測(cè)技術(shù)培訓(xùn)并合格，定期為實(shí)驗(yàn)室人員進(jìn)行時(shí)長不低于1 W的核酸理論和實(shí)際操作專項(xiàng)培訓(xùn)。

2.2 試劑的儲(chǔ)存

相對(duì)于酶免疫試劑，核酸檢測(cè)試劑種類多樣，且對(duì)溫度敏感，分別要求于-20℃、-4℃～8℃及常溫25℃環(huán)境中，故在接收試劑時(shí)需要對(duì)其進(jìn)行嚴(yán)格的運(yùn)輸溫度檢查以及到貨是質(zhì)量檢查，確認(rèn)不同種類試劑在運(yùn)輸過程中的溫度控制是否滿足說明書要求，試劑是否有破損，是否存在外包裝標(biāo)識(shí)或者條碼不完整等情況。在儲(chǔ)存時(shí)，試劑儲(chǔ)存區(qū)僅用于核酸試劑和耗材的存儲(chǔ)，是核酸擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室最為“潔凈”的區(qū)域，不應(yīng)有任何核酸的存在。核酸質(zhì)控品和試劑盒中的陽性對(duì)照不能進(jìn)入試劑儲(chǔ)存區(qū)，可存放于樣本處理區(qū)冷凍保存[2]。

2.3 標(biāo)本的采集

在影響血液篩查結(jié)果的眾多因素中，標(biāo)本因素是首要的[3]。用于核酸檢測(cè)實(shí)驗(yàn)的采血管必須采用無菌、無DNA酶、無RNA酶、帶惰性分離膠、一次性使用的EDTA-K2抗凝真空采血管，采血管應(yīng)無裂痕，無滲漏[4]。標(biāo)本采集過程中若遇采血管負(fù)壓不足，應(yīng)更換一支采血管重新留樣，標(biāo)記后兩管同時(shí)送檢。嚴(yán)禁開帽留樣，以防外界酶及抑制物進(jìn)入標(biāo)本，影響檢測(cè)結(jié)果。

2.4 樣本的處理

①盡量減少開蓋樣本在實(shí)驗(yàn)室環(huán)境中的暴露時(shí)間。實(shí)驗(yàn)開始前在生物安全柜或正壓環(huán)境中使用全自動(dòng)開蓋系統(tǒng)或手工開蓋，加樣結(jié)束后，立即使用一次性使用的硅膠塞或試管帽對(duì)樣本密封，避免未知核酸陽性樣本對(duì)陰性樣本的污染，從而影響拆分結(jié)果。

②實(shí)驗(yàn)過程中避免在已開蓋的樣本上方活動(dòng)，以免抑制物進(jìn)入標(biāo)本，導(dǎo)致假陰性。

③檢測(cè)后核酸樣本放置在冰箱指定位置暫存，經(jīng)高壓蒸汽滅菌器消毒處理后按醫(yī)療廢物處置。

2.5 陰、陽性對(duì)照和質(zhì)控品的配制

設(shè)立陰、陽性對(duì)照有利于監(jiān)測(cè)反應(yīng)體系各成份的污染情況。但陽性對(duì)照和質(zhì)控品在核酸提取設(shè)備中混勻、振蕩時(shí)會(huì)產(chǎn)生氣溶膠或液滴濺出，成為潛在的污染源。核酸實(shí)驗(yàn)室陰、陽性對(duì)照的配制及質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品的復(fù)融、混勻、開蓋均應(yīng)在生物安全柜中進(jìn)行。為防止陽性對(duì)照和質(zhì)控品對(duì)標(biāo)本造成污染，應(yīng)在標(biāo)本全部上機(jī)后，再配制陰、陽性對(duì)照和質(zhì)控品[5]。陽性對(duì)照及質(zhì)控品復(fù)融后應(yīng)先確認(rèn)各管帽已擰緊，上下顛倒混勻時(shí)液體不會(huì)濺出或漏出，混勻后離心，把管壁和管帽上的液體收集于管底，防止開蓋時(shí)液體濺出污染生物安全柜。開蓋后在生物安全柜內(nèi)靜置5 s以上，待管內(nèi)產(chǎn)生的氣溶膠經(jīng)生物安全柜抽濾清除后再轉(zhuǎn)移至樣本架。

2.6 試劑配制及耗材擺放

試劑和耗材均屬于潔凈無污染的實(shí)驗(yàn)物品，使用前認(rèn)真檢查試劑和耗材外觀，應(yīng)無破損、滲漏等。配制試劑時(shí)應(yīng)正確使用加樣器，吸樣時(shí)，應(yīng)緩慢勻速，避免液體濺到加樣器頭上，盡量一次性吸完，忌反復(fù)多次抽吸，以免交叉污染或產(chǎn)生氣溶膠。打出液體后拇指不應(yīng)松開按鈕，應(yīng)先將吸嘴壓掉再將拇指松開，避免液體回吸[6]。核酸提取結(jié)束后，取下廢棄試劑和耗材，用自封袋密封后放入醫(yī)療廢物桶中。

2.7 核酸擴(kuò)增

擴(kuò)增產(chǎn)物是最容易出現(xiàn)的污染，通常一次典型的PCR擴(kuò)增可以產(chǎn)生109拷貝的靶序列，若氣溶膠化，最小的氣溶膠都會(huì)含106拷貝的擴(kuò)增序列，這些氣溶膠的累積會(huì)污染實(shí)驗(yàn)室內(nèi)的試劑、儀器設(shè)備和通風(fēng)設(shè)備，使檢測(cè)結(jié)果出現(xiàn)異常[7]。因此，應(yīng)對(duì)核酸擴(kuò)增的每一個(gè)環(huán)節(jié)進(jìn)行嚴(yán)格的規(guī)范操作。

①擴(kuò)增反應(yīng)液和樣本核酸模板分裝完畢檢查管內(nèi)液面高度一致后，加蓋八聯(lián)管蓋，逐孔按緊，混勻離心后再次檢查八聯(lián)管有無滲漏。

②八聯(lián)管轉(zhuǎn)移至96孔擴(kuò)增盤時(shí)再次確認(rèn)管蓋已封嚴(yán)，以防擴(kuò)增過程中爆管導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)室污染[8]。

③擴(kuò)增結(jié)束后要及時(shí)將擴(kuò)增產(chǎn)物從擴(kuò)增儀里取出（禁止打開八聯(lián)管），檢查管內(nèi)液面無變化后放入自封袋內(nèi)封嚴(yán)，然后帶出擴(kuò)增區(qū)，按醫(yī)療廢物處理。每次擴(kuò)增后，可使用可移動(dòng)紫外燈對(duì)擴(kuò)增熱循環(huán)儀進(jìn)行照射。

2.8 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后的清潔消毒

清潔消毒方法不當(dāng)也是實(shí)驗(yàn)室污染的一個(gè)主要原因，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后應(yīng)遵從先清潔區(qū)域后污染區(qū)域消毒的原則，及時(shí)對(duì)實(shí)驗(yàn)室空氣、設(shè)備表面、工作臺(tái)面和地面等實(shí)施有效的消毒。核酸實(shí)驗(yàn)室不同的實(shí)驗(yàn)區(qū)域應(yīng)有其各自的清潔用具以防交叉污染。先用75%酒精對(duì)實(shí)驗(yàn)室空氣進(jìn)行密集噴淋，以對(duì)實(shí)驗(yàn)過程中產(chǎn)生的氣溶膠產(chǎn)生較好的沉降效果。噴淋結(jié)束立即采用500 mg/L的84液擦拭工作臺(tái)面/拖擦地面，作用10 min后用清水擦拭工作臺(tái)面，以防止84液殘留抑制實(shí)驗(yàn)結(jié)果；設(shè)備表面用一次性潔凈紗布沾取75%酒精擦拭消毒。擦拭消毒結(jié)束工作人員離開實(shí)驗(yàn)室，打開實(shí)驗(yàn)室各處的紫外燈和紫外燈車對(duì)實(shí)驗(yàn)室空氣和臺(tái)面照射消毒，照射時(shí)間≥1 h。

2.9 儀器和設(shè)備

應(yīng)該給予實(shí)驗(yàn)室配備滿足檢驗(yàn)工作需要的相關(guān)核算檢測(cè)系統(tǒng)、混樣儀、生物安全柜、離心機(jī)、樣品開蓋機(jī)、冷藏冷凍、不間斷電源（UPS）、消毒柜等基本設(shè)備，并且在系統(tǒng)及設(shè)備安裝、運(yùn)行過程中對(duì)其及逆行效能、交叉污染、穩(wěn)定性檢測(cè)，在廠家提供的操作說明書的基礎(chǔ)上，制定檢測(cè)過程中或者日維護(hù)、周維護(hù)、月維護(hù)和校準(zhǔn)驗(yàn)證計(jì)劃，確保設(shè)備正常有效運(yùn)行。

3 其它方面

3.1 每個(gè)月對(duì)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行環(huán)境監(jiān)測(cè)

監(jiān)測(cè)實(shí)驗(yàn)室是否存在污染，清潔消毒效果是否良好?？墒褂貌潦梅▽?duì)冰箱門把手、實(shí)驗(yàn)室門把手、實(shí)驗(yàn)室臺(tái)面、生物安全柜、設(shè)備臺(tái)面、傳遞窗等部位進(jìn)行監(jiān)測(cè)，用空氣沉降法對(duì)實(shí)驗(yàn)室各區(qū)空氣質(zhì)量進(jìn)行監(jiān)測(cè)。任一方法/部位環(huán)境監(jiān)測(cè)結(jié)果不合格，均應(yīng)采取相應(yīng)措施加強(qiáng)實(shí)驗(yàn)室清潔消毒，直至環(huán)境監(jiān)測(cè)結(jié)果全部合格。

3.2 實(shí)驗(yàn)室溫、濕度控制

相對(duì)條件下，氣溶膠濃度與溫度是負(fù)相關(guān)，與濕度成正相關(guān)[7]，可在規(guī)范要求范圍內(nèi)合理控制實(shí)驗(yàn)室溫度、濕度的波動(dòng)范圍，減少氣溶膠的產(chǎn)生。

3.3 防護(hù)措施

實(shí)驗(yàn)過程中必須穿戴工作衣、帽、口罩，戴一次性無粉手套，疑有污染立即更換。

3.4 消毒設(shè)備

紫外燈管累計(jì)工作1 000 h或輻射強(qiáng)度低于70 μW/cm2時(shí)應(yīng)更換燈管。

3.5 對(duì)儀器設(shè)備的輔助用品如離心機(jī)，離心杯，試管架，手推車等定期進(jìn)行消毒

核酸檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室防污染措施可結(jié)合實(shí)驗(yàn)過程中的具體操作方法以達(dá)到最佳效果，措施包括但不僅限于上面幾種。細(xì)節(jié)決定成敗，尤其對(duì)于實(shí)驗(yàn)環(huán)境和操作要求極高的核酸實(shí)驗(yàn)室，任何一個(gè)環(huán)節(jié)做不好都可能影響整個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果。因此，操作人員應(yīng)具有“無核酸”“無基因”概念[9]，把防污染思想貫穿于整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中，嚴(yán)格遵守操作規(guī)程，保證檢測(cè)質(zhì)量，確保臨床用血安全。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 林松峰.核酸實(shí)驗(yàn)室溫濕度控制、清潔消毒及防污染措施[J].醫(yī)療裝備，2016，29（22）：43-44.

[2] 陳越康，李活，王飛，等.核酸篩查實(shí)驗(yàn)室RNA酶污染防止對(duì)策探討[J].中國自然醫(yī)學(xué)雜志，2007，9（2）：137-138.

[3] 余霖，陳慶愷，何子毅.核酸檢測(cè)應(yīng)注意的幾個(gè)問題[J].臨床輸血與檢驗(yàn)，2017，19（5）：528-529，536.

[4] 國家衛(wèi)生計(jì)生委.血站技術(shù)操作規(guī)程（2015版）（Z），2015-12-17.

[5] 李園.PCR實(shí)驗(yàn)室的消毒與防污染措施[J].檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)與臨床，2010，7（3）：285-286.

[6] 李金明.實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)[M].北京.人民軍醫(yī)出版社，2014.

[7] 倪沈陽，石巍，陳琬玥，等.溫濕度對(duì)氣溶膠濃度影響的模擬研究[J].吉林建筑大學(xué)學(xué)報(bào)，2016，33（6）：53-56.

[8] 蔡麗娜，陳寶安.核酸擴(kuò)增技術(shù)（NAT）在獻(xiàn)血者血液初篩中的應(yīng)用現(xiàn)狀[J].中國實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志，2014，22（4）：1171-1177.

[9] 冷嬋，王中梅，于磊，等.血站核酸檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室風(fēng)險(xiǎn)識(shí)別、評(píng)估及控制方法探討[J].中國輸血雜志，2011，24（7）：547-550.

（收稿日期：2018-06-19）