果蔗脫毒種苗甘蔗花葉病、黃葉病和宿根矮化病分子檢測

王凱莉　鄧權清　竇志敏　古筱涵　王明強　沈萬寬

摘要

為監(jiān)測2016-2017年種植的果蔗脫毒種苗脫毒效果，分別采集廣州市南沙區(qū)和增城區(qū)、湛江市麻章區(qū)及華南農(nóng)業(yè)大學甘蔗育種基地共83份果蔗脫毒種苗樣本，進行甘蔗花葉病毒（SCMV）、高粱花葉病毒（SrMV）和甘蔗黃葉病毒（SCYLV）RTPCR檢測。結(jié)果表明SCMV的陽性樣本數(shù)為3個，陽性檢出率3.61%；SrMV的陽性樣本數(shù)為0；SCYLV的陽性樣本數(shù)為78個，陽性檢出率93.98%。采用常規(guī)PCR和巢式PCR技術對采集于廣州市增城區(qū)和華南農(nóng)業(yè)大學甘蔗育種基地的30份果蔗脫毒種苗樣本進行宿根矮化病菌（Lxx）檢測，常規(guī)PCR檢測陽性樣本數(shù)為0，巢式PCR檢測疑似陽性樣本數(shù)為8，疑似陽性檢出率26.67%。本研究采用莖尖組織培養(yǎng)脫毒技術培育的果蔗脫毒種苗能有效脫除果蔗種苗內(nèi)的SCMV、SrMV和Lxx，但SCYLV的脫除效果有待進一步研究。

關鍵詞

果蔗脫毒種苗； 甘蔗花葉病； 甘蔗黃葉?。?甘蔗宿根矮化??； 分子檢測

中圖分類號：

S 435.661

文獻標識碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2017321

Molecular detection of sugarcane mosaic disease， sugarcane yellow leaf

disease and ratoon stunting disease in virusfree seedlings of fruit cane

WANG Kaili， DENG Quanqing， DOU Zhimin， GU Xiaohan， WANG Mingqiang， SHEN Wankuan

（College of Agriculture， South China Agricultural University， Scientific Observing and Experimental

Station of Crop Cultivation in South China， Ministry of Agriculture， Guangzhou 510642， China）

Abstract

To survey the virus elimination effect of virusfree fruit cane seedlings， we collected 83 samples of virusfree seedling from Nansha District and Zengcheng District of Guangzhou， Mazhang District of Zhanjiang and sugarcane breeding base of South China Agricultural University （SCAU） to detect Sugarcane mosaic virus （SCMV）， Sorghum mosaic virus （SrMV） and Sugarcane yellow leaf virus （SCYLV） by RTPCR in 2016-2017. The results showed that three positive samples of SCMV was found， with the positive detection rate of 3.61%. The positive sample of SrMV was not found. The number of positive samples of SCYLV was 78， and its positive detection rate was 93.98%. We also collected 30 samples of virusfree seedling from Zengcheng District of Guangzhou and sugarcane breeding base of SCAU to detect the pathogen （Lxx） caused ratoon stunting disease （RSD） based on nested PCR or conventional PCR. The results showed that conventional PCR failed to detect the positive samples， but nested PCR found 8 suspected positive samples， with the suspected positive detection rate of 26.67%. In this study， the virusfree seedlings developed by techniques of shoot apical meristem culture can effectively remove SCMV， SrMV and Lxx in the fruit cane seedlings， but the removal effect of SCYLV needs further study.

Key words

virusfree seedling of fruit cane； sugarcane mosaic disease； sugarcane yellow leaf disease； ratoon stunting disease； molecular detection

果蔗是我國南方優(yōu)勢特色經(jīng)濟作物，廣東是我國主要果蔗產(chǎn)區(qū)，生產(chǎn)基地主要分布在廣州、湛江、江門、清遠、韶關等地區(qū)。2012年廣東省果蔗種植面積達1.99萬hm2，總產(chǎn)量189.91萬t，占全省當年甘蔗（含糖蔗）總種植面積的12.03%和總蔗莖產(chǎn)量的12.93%[1]。果蔗生產(chǎn)投入高于糖蔗，但平均單產(chǎn)也明顯高于糖蔗，蔗莖產(chǎn)量可達到120～150 t/hm2，經(jīng)濟效益較好[2]。我國種植的果蔗品種主要以黑皮果蔗‘Badila為主，蔗汁味道清甜可口，具有豐富的營養(yǎng)價值和藥用價值，深受廣大消費者喜愛。但由于果蔗品種單一，多年無性繁殖，易受甘蔗花葉病sugarcane mosaic disease （SMD）、甘蔗黃葉病sugarcane yellow leaf disease （SYLD）和宿根矮化病ratoon stunting disease （RSD）等種苗傳播病害的危害[35]，造成植株變矮，品質(zhì)變差，產(chǎn)量降低等嚴重問題。甘蔗花葉病主要由甘蔗花葉病毒Sugarcane mosaic virus （SCMV）和高粱花葉病毒Sorghum mosaic virus （SrMV）引起[6]。甘蔗黃葉病病原為甘蔗黃葉病毒Sugarcane yellow leaf virus （SCYLV）[7]。甘蔗宿根矮化病由木質(zhì)部限制性病原菌Leifsonia xyli subsp. xyli（Lxx）引起，是甘蔗主要的細菌病害之一[8]。

近年來，甘蔗花葉病在廣西、云南等果蔗產(chǎn)區(qū)普遍發(fā)生，其中主栽品種‘黑皮果蔗發(fā)病率高達100%，產(chǎn)量下降12.3%～33.5%，糖分下降6%～14%[911]。甘蔗黃葉病于2003年首次在廣西南寧的果蔗上發(fā)現(xiàn)[12]，之后李海明等[13]、周國輝等[14] 調(diào)查發(fā)現(xiàn)福建、廣西、廣東和海南等果蔗主產(chǎn)區(qū)普遍存在果蔗被SCYLV侵染的情況。本實驗室于2016年對采集于廣東蔗區(qū)的106份果蔗樣本進行了SCMV、SrMV和SCYLV檢測， 發(fā)現(xiàn)SCMV、SrMV和SCYLV的陽性檢出率分別為98.1%、97.2%和95.3%。在我國果蔗生產(chǎn)區(qū)，甘蔗宿根矮化病的發(fā)生也十分嚴重。吳夏明等[15]對6個果蔗品種進行了Lxx檢測，結(jié)果表明，‘廣東黃皮感染率為75%，‘云南紅皮、‘黔蔗08688、‘黔糖3號和‘Badila檢出率均為100%。楊湛端等[16]對廣州番禺120個果蔗樣本進行了調(diào)查，表明‘黑皮果蔗的Lxx檢出率為93%，‘廣東黃皮的Lxx檢出率為95%。

脫毒種苗是防治上述種傳病害的主要措施，李松等[17]報道甘蔗莖尖脫毒苗，甘蔗花葉病病原去除率為75%，甘蔗宿根矮化病菌去除率為70%。1991年我國臺灣糖業(yè)研究所開始利用組織培養(yǎng)脫毒技術進行果蔗脫毒種苗的研究，但主要集中在脫毒種苗的培養(yǎng)及田間生長試驗[18]，而對田間種植的果蔗脫毒種苗目的病害的跟蹤檢測卻鮮有報道，因此，難以評估脫毒種苗對各種目標病害的脫除效果。近年來，本課題組利用莖尖組織培養(yǎng)技術（經(jīng)檢測原果蔗植株帶有甘蔗花葉病、甘蔗黃葉病、宿根矮化?。┡嘤艘慌崦摱痉N苗，并在廣東蔗區(qū)建立苗圃擴繁。為了監(jiān)測這批果蔗脫毒種苗的脫毒效果，我們跟蹤取樣并對主要目標病害（花葉病、黃葉病、宿根矮化?。┻M行分子檢測，為客觀評價該批果蔗脫毒種苗的脫毒效果及脫毒技術提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

2017年3月-6月分別在廣東湛江假植苗圃、增城一級苗圃、南沙二級苗圃和廣州華南農(nóng)業(yè)大學甘蔗育種基地一級苗圃隨機采集果蔗脫毒種苗新葉下第一片葉，共83份樣本，放于-80℃儲存，用于甘蔗花葉病和黃葉病檢測。

2017年5月在廣東增城一級苗圃和廣州華南農(nóng)業(yè)大學甘蔗育種基地一級苗圃隨機選取10個月株齡果蔗脫毒種苗主莖30份樣本，參照沈萬寬等[19]的方法提取樣品蔗汁放于-80℃儲存，用于甘蔗宿根矮化病檢測。

1.2 總RNA和DNA的提取

參照Xie等[20]的方法，用改進的CTAB法提取蔗葉總RNA。參照沈萬寬等[19]的方法，用CTAB法提取蔗汁總DNA。

1.3 甘蔗花葉病和黃葉病的RTPCR檢測

采用Xu等[21]和許東林等[22]報道的SCMV、SrMV和SCYLV特異性引物（表1），委托上海生工生物工程有限公司合成。以提取的蔗葉總RNA為模板，使用南京Vazyme生物有限公司的HiScript Ⅱ One Step RTPCR Kit進行RTPCR擴增。擴增體系為25.0 μL：2×One Step Mix 12.5 μL，上下游引物（5 μmol/L）各1.0 μL，Enzyme Mix 1.0 μL，模板1.5 μL，加RNasefree ultra pure H2O至25.0 μL。擴增程序為：50℃反轉(zhuǎn)錄30 min；94℃預變性2 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，35個循環(huán)；最后72℃延伸5 min。反應程序結(jié)束后，擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，在Tanon1600凝膠成像系統(tǒng)中觀察結(jié)果并拍照保存。

1.4 甘蔗宿根矮化病菌的PCR檢測

1.4.1 常規(guī)PCR檢測

采用Pan等[23]報道的甘蔗宿根矮化病菌特異性引物Lxx1：5′CCGAAGTGAGCAGATTGACC3′和Lxx2：5′ACCCTGTGTTGTTTTCAACG3′進行PCR擴增。引物委托上海生工生物工程有限公司合成。預期擴增產(chǎn)物長度為438 bp。以蔗汁總DNA為模板進行PCR擴增，反應體系20.0 μL：模板1.0 μL，10×Buffer（含Mg2+）2.0 μL，dNTPs （2.5 mmol/L）1.6 μL，引物Lxx1/Lxx2（5 μmol/L）各1.0 μL，Taq DNA聚合酶（5 U/μL）0.2 μL，用超純H2O補足至20.0 μL。擴增程序為：94℃預變性2 min；94℃變性30 s，54℃退火30 s，72℃延伸60 s，進行35個循環(huán)；最后72℃延伸5 min。PCR反應結(jié)束后，擴增產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳，在Tanon1600凝膠成像系統(tǒng)中觀察結(jié)果并拍照保存。

1.4.2 巢式PCR檢測

參照沈萬寬等[24]的方法。第一輪擴增采用細菌ITS通用引物ITS1：5′AGTCGTAACAAGGTAGCCGT3′和ITS2：5′GTGCCAAGGCATCCACC3′進行PCR擴增。引物委托上海生工生物工程有限公司合成，反應體系及擴增程序同1.4.1，其中退火溫度為56℃，循環(huán)30次。以第一輪擴增產(chǎn)物為模版，采用宿根矮化病菌特異性引物Lxx1/Lxx2進行第二輪PCR擴增，反應體系及擴增程序均同1.4.1。反應結(jié)束后，擴增產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳，在Tanon1600凝膠成像系統(tǒng)中觀察結(jié)果并拍照保存。

1.5 序列測定與分析

RTPCR和PCR產(chǎn)物核苷酸序列委托上海生工生物工程有限公司測定，一致性比較在NCBI數(shù)據(jù)庫中通過BLAST程序進行，應用DNAstar V 7.1軟件進行序列分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 甘蔗花葉病和甘蔗黃葉病RTPCR檢測結(jié)果

采用SCMV、SrMV和SCYLV的特異引物對83份果蔗脫毒種苗樣本進行SCMV、SrMV和SCYLV的RTPCR檢測。結(jié)果表明，SCMV的陽性樣本數(shù)為3個，陽性檢出率為3.61%，且3個陽性樣本均來自廣州市南沙區(qū)的二級苗圃，其他苗圃均未檢出陽性樣本。SCYLV的陽性樣本數(shù)為78個，陽性檢出率為93.98%。本批樣本中未檢測出SrMV陽性樣本（表2，圖1）。

選取的代表性陽性樣本經(jīng)測序及比對，采自廣州市南沙區(qū)的‘黑皮果蔗2號樣本的SCMV擴增產(chǎn)物核苷酸序列（MF957202）與GenBank中已報道的中國廣東（EF419174）、云南（FM997890）和阿根廷（EU196448）的SCMV株系或分離物相應區(qū)域核苷酸序列一致性高達97%～99%，確認該產(chǎn)物為SCMV核苷酸片段。廣州市南沙區(qū)的‘黑皮果蔗1號樣本擴增出的SCYLV核苷酸序列（MF957203）與GenBank中已報道的來自印度（KF680098）、哥倫比亞（AF369928）的SCYLV分離物相應區(qū)域核苷酸序列有99%的一致性，由此證實該產(chǎn)物為SCYLV核苷酸片段。

2.2 甘蔗宿根矮化病PCR檢測結(jié)果

采用引物Lxx1/Lxx2對30份果蔗脫毒種苗樣本進行常規(guī)PCR檢測，產(chǎn)物電泳未檢測到目的條帶。采用引物ITS1/ITS2和Lxx1/Lxx2對30份果蔗脫毒種苗進行巢式PCR檢測，除了陽性對照外，有8個樣本出現(xiàn)與預期目的片段大小一致的條帶（條帶極弱，約438 bp），且空白對照（無菌水）未出現(xiàn)條帶（圖2）。由于目的條帶極弱，測序未成功，故將檢測出的8個樣本定為疑似宿根矮化病陽性樣本，RSD疑似樣本陽性檢出率為26.67% （表3）。

3 討論

世界上已報道的甘蔗花葉病病原有SCMV、SrMV、SCSMV（甘蔗線條花葉病毒）、MDMV（玉米矮花葉病毒）、JGMV（約翰遜草花葉病毒）和ZeMV（玉米花葉病毒）[25]，但引起我國蔗區(qū)甘蔗花葉病的病原主要為SCMV、SrMV和SCSMV，且引起糖蔗和果蔗的花葉病優(yōu)勢病原有所差異，糖蔗上花葉病的優(yōu)勢病毒為SrMV和SCSMV[6， 2628]，而果蔗上花葉病的優(yōu)勢病毒為SCMV[2930]，即糖蔗和果蔗進行花葉病病原脫除時目的病原不同。本研究對83份果蔗脫毒種苗進行SCMV、SrMV檢測，SCMV陽性檢出率為3.61%（3/83），SrMV未檢出陽性樣品，且3個SCMV陽性樣本均采自廣州市南沙區(qū)的二級苗圃，其他采樣點均未檢測出陽性樣品。這3個陽性樣本所攜帶的SCMV極有可能是外源病毒通過蔗刀或蚜蟲傳播至脫毒種苗，種苗自身攜帶SCMV的可能性較小。由此說明本批采用莖尖組織培養(yǎng)脫毒技術培育的果蔗脫毒種苗對果蔗種苗內(nèi)的SCMV、SrMV的脫除是有效的。

本研究中，SCYLV陽性樣本檢出率高達93.98%（78/83），且假植苗圃、一級苗圃、二級苗圃陽性檢出率均較高。相關研究表明，植物病毒基因能夠整合入寄主植物基因組中，如Bennetzen[31]指出反轉(zhuǎn)錄功能蛋白可以把RNA反轉(zhuǎn)錄為DNA，從而使PRVs（植物擬逆轉(zhuǎn)錄病毒）整合入寄主植物基因組中。且當PRVs基因片段侵入含有反式激活蛋白轉(zhuǎn)基因的植物，此病毒可以利用基因產(chǎn)物來完成侵染循環(huán)[32]。由于SCYLV與甘蔗桿狀病毒Sugarcane bacilliform virus （SCBV）的寄主均為甘蔗，因此懷疑SCYLV是否同SCBV一樣，能將SCYLV全部或部分基因組整合入甘蔗基因組內(nèi)，和甘蔗基因組同步進行復制表達，并且利用這種方式進行侵染。如果推斷成立，則SCYLV是無法應用植物組織培養(yǎng)技術脫除的。另外，Mishra等[33]研究表明，當以1.5 mm以下甘蔗莖尖分生組織作為外植體進行組織培養(yǎng)時，能有效脫除SCYLV，而當以超過1.5 mm莖尖分生組織作外植體時，所獲得的甘蔗組培苗不能有效脫除SCYLV。本研究也有可能在進行甘蔗組織培養(yǎng)時，所取外植體莖尖分生組織過大，造成不能有效脫除SCYLV。建議今后進行果蔗組培脫毒時，所取外植體不超過1.5 mm。

甘蔗宿根矮化病菌Lxx寄生于甘蔗木質(zhì)部維管束中，成熟蔗莖的木質(zhì)部維管束發(fā)達，Lxx含量較高，而幼嫩的莖尖分生組織木質(zhì)部尚未分化形成或極不發(fā)達，因此，Lxx不存在或含量極低[34]。選取較小的甘蔗莖尖分生組織作為外植體較易脫除甘蔗宿根矮化病菌（Lxx）。本研究采用常規(guī)PCP方法未檢測出Lxx陽性樣本，而應用較常規(guī)PCR檢測靈敏度大幅度提高的巢式PCR技術[3536]，也僅檢測出8個樣本有疑似目的條帶（測序未成功），假如這8個均為Lxx陽性樣品，其攜帶的Lxx的含量也是極低的?？梢姳九捎们o尖組織培養(yǎng)脫毒技術培育的果蔗脫毒苗對種苗內(nèi)的Lxx的脫除是有效的。

參考文獻

[1] 廣東省統(tǒng)計局.廣東農(nóng)村統(tǒng)計年鑒[M].北京：中國統(tǒng)計出版社，2014.

[2] 王繼華，曹干，張劍亮，等.我國果蔗產(chǎn)業(yè)的現(xiàn)狀與可持續(xù)發(fā)展[J].甘蔗糖業(yè)，2013（5）：5661.

[3] SEIFERS D L， SALOMON R， MARIEJEANNE V， et al. Characterization of a novel potyvirus isolated from maize in Israel [J]. Phytopathology， 2000， 90（5）：505513.

[4] HEMA M， JOSEPH J， GOPINATH K， et al. Molecular characterization and interviral relationships of a flexuous filamentous virus causing mosaic disease of sugarcane （Saccharum officinarum L.） in India [J]. Archives of Virology， 1999， 144（3）：479490.

[5] MAYO M A.Changes to virus taxonomy 2004 [J]. Archives of Virology， 2005， 150（1）：189198.

[6] 李文鳳，丁銘，方琦，等.云南甘蔗花葉病病原的初步鑒定[J].中國糖料，2006（2）：47.

[7] 許東林，李俊光，周國輝.廣東甘蔗黃葉病田間調(diào)查及病原病毒的分子檢測[J].植物病理學報，2006，36（5）：404406.

[8] KAO J， DAMANN K E J. In situ localization and morphology of the bacterium associated with ratoon stunting disease of sugarcane [J]. Canadian Journal of Botany， 1980， 58（3）：310315.

[9] 徐金龍.果蔗病害及其防治[J].中國果業(yè)信息，2001（11）：34.

[10]王倫旺，譚裕模，賢武，等.健康種苗技術在果蔗優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)栽培中的應用[J].廣西農(nóng)業(yè)科學，2005，36（6）：572574.

[11]黃應昆，李文風，盧文潔，等.云南蔗區(qū)甘蔗花葉病流行原因及控制對策[J].云南農(nóng)業(yè)大學學報，2007，22（6）：935938.

[12]許東林，周國輝，任小平，等.廣東甘蔗引種基地甘蔗黃葉病毒分子鑒定[J].植物病理學報，2005，35（5）：466468.

[13]李海明，張樹河，吳松海，等.侵染果蔗的甘蔗黃葉病毒RTPCR檢測鑒定[J].福建農(nóng)業(yè)學報，2012（8）：831834.

[14]周國輝，許東林，蔡艷清，等.我國南方甘蔗病毒種類初步鑒定[J].廣西農(nóng)業(yè)生物科學，2006，25（3）：226228.