甘薯褪綠矮化病毒RNase3蛋白的原核表達(dá)及抗血清制備

秦艷紅　喬奇　王爽　張德勝　王永江　田雨婷　張振臣

摘要

以本實(shí)驗(yàn)室保存的重組質(zhì)粒為模板，利用PCR方法擴(kuò)增獲得了甘薯褪綠矮化病毒SPCSV的RNase3基因，RNase3基因由690個(gè)核苷酸組成，編碼229個(gè)氨基酸。將RNase3基因克隆到原核表達(dá)載體pET28a（+），轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3），經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，對誘導(dǎo)產(chǎn)物進(jìn)行SDSPAGE分析。結(jié)果表明，RNase3在大腸桿菌中能高效表達(dá)，融合蛋白分子量約為26.5 kD。以表達(dá)的融合蛋白為抗原，免疫家兔，制備了SPCSVRNase3的特異性抗血清。ACPELISA檢測結(jié)果表明，制備的抗血清對RNase3融合蛋白的效價(jià)達(dá)10萬倍。

關(guān)鍵詞

甘薯褪綠矮化病毒； RNase3基因； 原核表達(dá)； 抗血清

中圖分類號：

S 432.41

文獻(xiàn)標(biāo)識碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2017298

Prokaryotic expression of RNase3 of Sweet potato chlorotic stunt virus and

preparation of its antiserum

QIN Yanhong， QIAO Qi， WANG Shuang， ZHANG Desheng，

WANG Yongjiang， TIAN Yuting， ZHANG Zhenchen

（Institute of Plant Protection， Henan Academy of Agricultural Sciences， Henan Key Laboratory of

Crop Pest Control， Key Laboratory of Integrated Pest Management on Crops in Southern Part of

North China， Ministry of Agriculture， Zhengzhou 450002， China）

Abstract

With the recombinant plasmid stored in our laboratory as template， RNase3 gene of Sweet potato chlorotic stunt virus （SPCSV） was amplified by PCR. The fulllength RNase3 gene consists of 690 nt and encodes 229 amino acid residues. The RNase3 gene was cloned into expression vector pET28a（+）for overexpression in prokaryotic cells. The recombinant plasmid pETRNase3 was transformed into Escherichia coli strain BL21（DE3）competent cells. SDSPAGE result showed that specific fusion protein with the molecular weight of about 26.5 kD was produced after induction by IPTG， indicating that the RNase3 fusion protein was highly expressed in prokaryotic cells. The expressed protein was purified from SDSPAGE and the antiserum against RNase3 protein was raised in rabbit. ACPELISA detection indicated that the titer of RNase3 antiserum was over 1∶100000 against RNase3 fusion protein.

Key words

Sweet potato chlorotic stunt virus； RNase3 gene； prokaryotic expression； antiserum

甘薯是重要的糧食作物、食品加工原料和新型能源作物。我國甘薯種植面積位居世界第一[1]。病毒病對甘薯產(chǎn)業(yè)造成很大影響。研究表明，我國甘薯上至少存在甘薯褪綠矮化病毒Sweet potato chlorotic stunt virus （SPCSV）和甘薯羽狀斑駁病毒Sweet potato feathery mottle virus （SPFMV）等20余種病毒[26]。SPCSV與SPFMV共同侵染可引起甘薯復(fù)合病毒?。⊿weet potato virus disease，SPVD），該病可使甘薯減產(chǎn)50%～98%，甚至絕收[7]。2010年，Qiao等首次報(bào)道了SPCSV在我國發(fā)生[8]。2012年，張振臣等首次證明我國甘薯上已發(fā)生SPVD[9]。近年來，SPCSV在我國的發(fā)生面積逐漸擴(kuò)大，在全國范圍內(nèi)迅速蔓延，對甘薯的危害日趨嚴(yán)重，是甘薯上危害最嚴(yán)重的病毒之一。

SPCSV隸屬長線形病毒科Closteroviridae毛形病毒屬Crinivirus，基因組為兩條單鏈正義RNA，RNA1編碼蛋白主要參與病毒的復(fù)制，RNA2編碼蛋白主要負(fù)責(zé)病毒的包裝和運(yùn)輸。RNA1上編碼的RNase3蛋白是其基因沉默抑制子，RNase3蛋白包含一個(gè)核糖核酸內(nèi)切酶結(jié)構(gòu)域和一個(gè)雙鏈RNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，RNase3可以抑制由正義RNA介導(dǎo)的RNA干擾（RNAi），在體外，RNase3可以將21、22和24 nt的siRNA切割成14 nt，RNase3的核糖核酸內(nèi)切酶活性對其沉默抑制活性是必需的[11]。RNase3蛋白還能夠增強(qiáng)p22蛋白的沉默抑制活性[12]，研究表明，RNase3單獨(dú)即可介導(dǎo)SPCSV與SPFMV等其他病毒的協(xié)生作用[11]。目前，對SPVD致病機(jī)理方面的研究還較薄弱，關(guān)于SPCSV與SPFMV等病毒協(xié)生作用的分子機(jī)理還不十分清楚，因此，本研究針對SPCSV編碼的RNase3這一重要蛋白，利用原核表達(dá)的策略，在大腸桿菌中表達(dá)了RNase3的融合蛋白，制備了SPCSV RNase3的多克隆抗體。

1 材料與方法

1.1 材料

大腸桿菌JM109和BL21（DE3）菌株，含RNase3基因的重組質(zhì)粒SPCSVRNA144108637T[10]和原核表達(dá)載體pET28a（+）均由本實(shí)驗(yàn)室保存；UNIQ10柱式DNA膠回收試劑盒購自Axygen公司；氨芐青霉素（Amp）、卡那霉素（Kan）、IPTG和SDS等購自上海生工生物工程有限公司；質(zhì)粒小量抽提試劑盒購自O(shè)mega生物科技公司；Ex Taq DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)和蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)等購自寶生物工程（大連）有限公司；其他常用試劑為國產(chǎn)分析純。

根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室測定的重組質(zhì)粒序列[10]，設(shè)計(jì)擴(kuò)增RNase3基因的引物，正向引物RNase3Bam HⅠ5F的序列為5′CGTGGATCCATGATTCCGATCTTTTCTGAT3′），與RNase3基因的1-21 nt位置對應(yīng)并引入BamHⅠ酶切位點(diǎn)，反向引物RNase3HindⅢ3R的序列為5′GGCAAGCTTTCAATTCAAATTTAGAGCTTCGAC3′，與RNase3的終止密碼子附近序列互補(bǔ)并引入了HindⅢ酶切位點(diǎn)，引物由上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 SPCSV RNase3基因的PCR擴(kuò)增

以重組質(zhì)粒SPCSVRNA144108637T為模板，以RNase3BamHⅠ5F和RNase3HindⅢ3R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為：正、反向引物各1 μL， 2.5 mmol/L的dNTP混合物4 μL，10×Ex Taq buffer 5 μL，Ex Taq DNA聚合酶0.5 μL，重組質(zhì)粒1 μL，ddH2O 37.5 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸40 s，共30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，按照Axygen公司UNIQ10柱式DNA膠回收試劑盒的說明書回收目的片段。

1.2.2 SPCSV RNase3基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建及序列測定

將1.2.1中的膠回收產(chǎn)物用BamHⅠ和HindⅢ酶切后與相應(yīng)酶切的pET28a（+）載體連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌JM109，提取質(zhì)粒，經(jīng)PCR擴(kuò)增和酶切篩選出重組質(zhì)粒，將重組質(zhì)粒pETRNase3送上海生工生物工程技術(shù)有限公司測序以驗(yàn)證閱讀框架的正確性。

1.2.3 SPCSV RNase3蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及SDSPAGE分析

將讀框正確的重組質(zhì)粒pETRNase3及空載體pET28a（+）轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3），挑取單菌落于2 mL LB培養(yǎng)液中（含100 μg/mL Kan），37℃振蕩培養(yǎng)過夜，將過夜培養(yǎng)的菌液按1∶100稀釋到新鮮的LB培養(yǎng)液中（含100 μg/mL Kan），振蕩培養(yǎng)至OD600達(dá)到0.6以上，加入IPTG至終濃度為1 mmol/L，于37℃繼續(xù)誘導(dǎo)6～8 h。取1.5 mL培養(yǎng)液，經(jīng)10 000 r/min離心1 min收集菌體，用50 μL滅菌ddH2O懸浮，加入50 μL 2×的樣品緩沖液 （40 mmol/L TrisHCl，10%甘油，2%SDS，5%巰基乙醇，0.1%溴酚藍(lán)，pH 6.8），顛倒混勻后，煮沸10 min，用12.5%的膠進(jìn)行SDSPAGE分析。

1.2.4 SPCSV RNase3抗血清的制備和效價(jià)測定

1.2.3中的原核表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDSPAGE電泳后，將凝膠用預(yù)冷的染色液（0.25 mol/L KCl，1 mmol/L DTT）染色至條帶清晰，切下所需的蛋白條帶，加入等體積0.85%的生理鹽水，于冰浴中研磨。12 000 r/min離心5 min，收集上清即為回收到的蛋白。利用回收的蛋白免疫家兔，經(jīng)過6次免疫后，獲得抗血清。利用ACPELISA對抗血清進(jìn)行效價(jià)測定。免疫家兔等工作由鄭州博賽生物技術(shù)公司協(xié)助完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 SPCSV RNase3基因原核表達(dá)載體構(gòu)建及表達(dá)產(chǎn)物SDSPAGE分析

利用PCR擴(kuò)增獲得大小約為690 bp目的條帶，將目的片段割膠回收，將膠回收產(chǎn)物和pET28a（+）質(zhì)粒分別利用BamHⅠ和HindⅢ酶切后進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，菌液PCR驗(yàn)證為陽性的樣品，提取質(zhì)粒后再進(jìn)行酶切鑒定（圖1a），并送上海生工生物工程有限公司測序，證明閱讀框架正確，表明原核表達(dá)載體pETRNase3構(gòu)建成功。

將pETRNase3和pET28a（+）分別轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21（DE3）中，利用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，分別以未誘導(dǎo)的pETRNase3和誘導(dǎo)的pET28a（+）為對照。經(jīng)過SDSPAGE分析表明，含有重組質(zhì)粒的工程菌誘導(dǎo)后可產(chǎn)生大小約為26.5 kD的目的蛋白，而對照沒有相應(yīng)條帶（圖1b），表明RNase3在大腸桿菌中得到了表達(dá)。

2.2 SPCSV RNase3抗血清的制備和效價(jià)測定

以純化的重組蛋白作為抗原免疫家兔，經(jīng)過6次免疫后獲得了SPCSVRNase3的抗血清，以RNase3的融合蛋白為抗原，利用ACPELISA對抗血清的效價(jià)進(jìn)行測定，結(jié)果表明，抗血清稀釋100 000倍后仍能與抗原發(fā)生陽性反應(yīng)（表1）。

3 討論

研究表明，SPCSV可以與多種甘薯病毒發(fā)生協(xié)生作用，使甘薯的癥狀加重，其他病毒的含量增加[1316]，RNase3介導(dǎo)了這一過程。表達(dá)植物病毒蛋白最常見的就是大腸桿菌表達(dá)體系，它具有產(chǎn)量高、成本低、生產(chǎn)周期短、表達(dá)穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，本研究利用原核表達(dá)的方法制備了SPCSVRNase3蛋白的抗血清，該抗血清對RNase3融合蛋白的效價(jià)可達(dá)100 000以上，可以用于RNase3融合蛋白的檢測。

利用純化的重組蛋白制備多克隆抗體，是目前抗體研究中普遍采用的一種方法，制備的抗體可以用于內(nèi)源蛋白的表達(dá)水平分析、蛋白質(zhì)的體外互作分析、免疫膠體金定位分析等試驗(yàn)[17]。因此，下一步可以通過Western blot技術(shù)利用制備的特異性抗體對RNase3在甘薯不同部位的分布和表達(dá)量的差異開展研究；另外，還可以通過酵母雙雜交技術(shù)篩選與SPCSVRNase3互作的其他協(xié)生病毒蛋白或寄主因子，將表達(dá)的融合蛋白應(yīng)用于RNase3蛋白與其他蛋白的體外互作驗(yàn)證。本研究為后續(xù)SPCSV的致病機(jī)理研究提供了材料，為探索新的抗病毒策略奠定基礎(chǔ)。

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（責(zé)任編輯：楊明麗）