核桃枝枯病小新殼梭孢巢式PCR檢測(cè)方法的建立

陳杰　朱天輝

摘要

近年來，小新殼梭孢Neofusicoccum parvum導(dǎo)致的核桃枝枯病屢有報(bào)道，該病防治困難，發(fā)病率高，是核桃的一種災(zāi)難性病害。為建立N.parvum的快速、靈敏的分子檢測(cè)體系，根據(jù)N.parvum的幾丁質(zhì)合酶1基因（CHS1）及其前后100 bp序列，分別設(shè)計(jì)了兩對(duì)特異性引物CTWK3S/CTWK3A和CTNS/CTNA，建立了N.parvum的巢式PCR檢測(cè)方法。結(jié)果表明，建立的體系可以從不同來源的5個(gè)N.parvum菌株中特異性地?cái)U(kuò)增出97 bp的目的條帶，靈敏度達(dá)30 fg/μL，是常規(guī)PCR的10倍，而從其近緣種葡萄座腔菌屬Botryosphaeria sp.的病原菌及其他供試菌株均未擴(kuò)增出任何條帶。以感染N.parvum的核桃組織總DNA為模板進(jìn)行檢測(cè)，可以在發(fā)病早期檢測(cè)出N.parvum的存在。本研究建立的巢式PCR體系可以為核桃枝枯病的田間檢測(cè)提供思路。

關(guān)鍵詞

核桃枝枯病； 小新殼梭孢菌； 分子檢測(cè)； 巢式PCR

中圖分類號(hào)：

S 763.13

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2017262

Establishment of nested PCR method for detecting the branch dieback of

walnut caused by Neofusicoccum parvum

CHEN Jie， ZHU Tianhui

（College of Forestry， Sichuan Agricultural University， Wenjiang 611130， China）

Abstract

The branch dieback of walnut caused by Neofusicoccum parvum has repeatedly been reported in recent years. The disease is a catastrophic disease of walnut with high incidence and is difficult to control. In order to establish a rapid and sensitive molecular detection system for N.parvum， two pairs of specific primers， CTWK3S / CTWK3A and CTNS / CTNA， were designed according to the sequence of chitin synthase 1 （CHS1） of N.parvum and 100 bp flanking sequences， and a nested PCR detection assay was established for N.parvum. The results showed that the established assay was specific to five strains of N.parvum from different sources and could amplify a 97 bp target with a sensitivity of 30 fg/μL， which was 10 times more sensitive than conventional PCR. No products were amplified in the related pathogenic species， Botryosphaeria sp.， as well as the other tested strains. Therefore， the total DNA of walnut infected by N.parvum can be used as a template to detect the presence of N.parvum early in the disease. The nested PCR system established in this study can provide ideas for field detection of walnut branch dieback.

Key words

walnut blight； Neofusicoccum parvum； molecular detection technology； nested PCR

據(jù)統(tǒng)計(jì)，目前我國(guó)核桃栽培面積達(dá)554.78萬hm2，占全國(guó)經(jīng)濟(jì)林總面積的14.96%，比2002年增加464.91萬hm2，有10個(gè)省（自治區(qū)）的種植面積在10萬hm2以上[1]。與此同時(shí)，核桃的各類病蟲害也日益頻發(fā)，其中核桃枝枯病在全國(guó)各地均有發(fā)生。引起核桃枝枯病的病原菌已報(bào)道的有矩圓黑盤孢M(jìn)elanconium oblongum[24]、胡桃黑盤孢M(jìn). juglandina[56]、胡桃楸擬莖點(diǎn)霉Phomopsis juglandina[7]、莖生擬莖點(diǎn)霉P.truncicola[8]和小新殼梭孢Neofusicoccum parvum[910]。目前國(guó)內(nèi)外研究較多的是M.oblongum，而對(duì)其他引起核桃枝枯病的病原菌則研究較少。2013年，Cheon等首次報(bào)道了N.parvum在韓國(guó)引起核桃枝枯病[11]，而后該病原菌引起的核桃枝枯病陸續(xù)又在我國(guó)山西和四川有過報(bào)道[1213]。

小新殼梭孢Neofusicoccum parvum屬子囊菌門Ascomycota，子囊菌綱Ascomycetes，假球殼目Pleosporales，葡萄座腔菌科Botryosphaericeae，新殼梭孢屬Neofusicoccum，在田間主要借風(fēng)、雨或昆蟲傳播，并可通過自然孔口或機(jī)械損傷等侵染枝條[14]。

近年來已發(fā)展了多種植物病原菌的分子檢測(cè)技術(shù)，其中巢式PCR擴(kuò)增技術(shù)是由內(nèi)外兩對(duì)引物先后對(duì)靶序列進(jìn)行擴(kuò)增，使其DNA拷貝數(shù)以雙重指數(shù)級(jí)增加，因而靈敏度也大幅度提高。該技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于多種植物病原菌的分子檢測(cè)，如荔枝霜疫霉[15]、菜豆暈疫病菌[16]、甘蔗黑穗病菌[17]、琯溪蜜柚黑斑病菌[18]、向日葵白銹病菌[19]等。

目前，國(guó)內(nèi)外關(guān)于核桃枝枯病分子檢測(cè)技術(shù)的研究鮮有報(bào)道。本研究根據(jù)N.parvum的CHS1基因及其前后100 bp序列設(shè)計(jì)特異性內(nèi)、外引物，擬建立一種快速、靈敏的巢式PCR檢測(cè)體系，為我國(guó)核桃枝枯病早期防治提供技術(shù)支持。

1 材料和方法

1.1 材料

菌株：供試菌株詳細(xì)信息見表1。

引物：采用Primer Premier 5.0和Oligo 6.0，根據(jù)GenBank中公布的N.parvum的CHS1和基因組序列，設(shè)計(jì)兩對(duì)特異性引物，即：外引物：CTWK3S（5′GTGTCTATCAGGACGGCATTG3′）/CTWK3A（5′CGAGGACGGTTCCAAAGG3′）預(yù)計(jì)擴(kuò)增片段大小為271 bp和內(nèi)引物CTNS（5′GGACGGCATTGCCAAGCA3′）/CTNA（5′TTAGCGTCTTTCCACGGGTCTT3′），預(yù)計(jì)擴(kuò)增片段大小為97 bp。引物由成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司合成。

馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基（PDB）：煮熟馬鈴薯濾液200 g/L，葡萄糖20 g/L；LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，氯化鈉10 g/L。固體培養(yǎng)基為在對(duì)應(yīng)液體培養(yǎng)基中加15～20 g/L瓊脂粉。

試劑及儀器：離心柱型植物基因組提取試劑盒（Plant Genomic DNA Kit DP305）、DL2000 DNA Marker、6×DNA Loading Buffer、2×Taq PCR Master Mix （KT201）及瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購自天根生化科技有限公司；大腸桿菌菌株Escherichia coli DH5α購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；pMD19T載體購自寶生物工程有限公司；50×TAE Buffer購自索萊寶科技有限公司；西班牙瓊脂糖，BIOWEST公司生產(chǎn)；Gold ViewⅠ核酸染色劑購自索萊寶科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 PCR模板的制備

菌株培養(yǎng)：用打孔器從接菌7 d的PDA平板中取直徑5 mm的菌餅接種于裝有滅菌PDB的錐形瓶中，28℃恒溫140 r/min振蕩培養(yǎng)5 d。

菌絲獲?。壕z的獲取參照何月秋[20]的方法，置于冰箱-20℃保存待用。

核桃發(fā)病組織獲?。河冕槾谭ㄔ诮】祪赡晟颂抑仓甑闹l上接種N.parvum菌餅，用無菌水噴濕后覆蓋保鮮膜置于室外通風(fēng)處，隨后觀察發(fā)病情況。在核桃枝枯病發(fā)病時(shí)期分不同發(fā)病情況（表2）用消毒后的刀片采集接種枝條的韌皮部，對(duì)樣品進(jìn)行表面消毒后置于冰箱-80℃保存待用。

DNA的提?。汉颂覙悠方M織DNA提取參照天根植物基因組DNA提取試劑盒（Plant Genomic DNA Extraction Kit）說明書；供試菌株DNA提取參照劉少華等[21]的方法。用Biomate 3S紫外可見核酸蛋白分析儀測(cè)定吸光值，估算DNA的質(zhì)量和濃度后置于-20℃保存待用。

1.2.2 PCR擴(kuò)增體系

常規(guī)PCR擴(kuò)增體系（50 μL）：2×Taq PCR Master Mix 25 μL，10 mmol/L外引物（或內(nèi)引物）各 2.0 μL，模板DNA 2.0 μL，用雙重蒸餾水補(bǔ)足至50 μL。程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5 min；94℃變性45 s，55℃退火45 s，72℃延伸20 s，33個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸8 min。

巢式PCR擴(kuò)增體系：以外引物進(jìn)行第一輪PCR，擴(kuò)增體系同常規(guī)PCR，擴(kuò)增程序除退火溫度改為53℃和延伸時(shí)間改為30 s外其他同常規(guī)PCR。取第一輪產(chǎn)物稀釋10倍后，以內(nèi)引物進(jìn)行第二輪擴(kuò)增，體系和程序同常規(guī)PCR。

電泳檢測(cè)：4%的瓊脂糖凝膠，110V電壓下電泳40 min。

1.2.3 巢式PCR引物退火溫度的篩選

以外引物和內(nèi)引物分別擴(kuò)增N.parvum基因組DNA，退火溫度梯度設(shè)置為45～55℃，其他程序及體系同1.2.2常規(guī)PCR。

1.2.4 巢式PCR引物特異性驗(yàn)證

用引物對(duì)CTWK3S/CTWK3A和CTNS/CTNA對(duì)所有供試菌株基因組DNA進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增，體系及程序見1.2.2巢式PCR。

1.2.5 PCR產(chǎn)物的克隆及序列分析

用引物對(duì)CTWK3S/CTWK3A和CTNS/CTNA對(duì)N.parvum基因組DNA進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物電泳后用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒純化、克隆至pMD19T載體中，并轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，取100 μL涂平板，37℃培養(yǎng)過夜，隨即挑取單菌落接種到LB培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)4 h，用菌液PCR篩選陽性克隆，隨機(jī)選擇3個(gè)陽性克隆送成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司測(cè)序。將得到的產(chǎn)物序列經(jīng)NCBI在線BLAST比對(duì)驗(yàn)證其來源，再用DNAMAN分析其與目的片段的一致性。

1.2.6 巢式PCR靈敏度試驗(yàn)

用特異性引物對(duì)CTNS/CTNA和CTWK3S/CTWK3A分別對(duì)濃度為300 ng/μL、30 ng/μL、3 ng/μL、300 pg/μL、30 pg/μL、3 pg/μL、300 fg/μL、30 fg/μL、3 fg/μL的N.parvum基因組DNA進(jìn)行常規(guī)PCR擴(kuò)增和巢式PCR擴(kuò)增，設(shè)置無菌ddH2O為陰性對(duì)照，擴(kuò)增體系及程序同1.2.2。

1.2.7 發(fā)病組織檢測(cè)

以1.2.1中不同發(fā)病等級(jí)的核桃組織及健康核桃組織的DNA作為模板，分別進(jìn)行CTWK3S/CTWK3A常規(guī)PCR、CTNS/CTNA常規(guī)PCR和巢式PCR，擴(kuò)增體系及程序同1.2.2。

2 結(jié)果與分析

2.1 巢式PCR引物退火溫度優(yōu)化

以外引物CTWK3S/CTWK3A進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)，不同退火溫度下擴(kuò)增N.parvum基因組DNA的結(jié)果見圖1，結(jié)果表明該對(duì)引物在退火溫度45～55℃時(shí)均能很好地?cái)U(kuò)增出目的條帶，且無雜帶產(chǎn)生。為了保證擴(kuò)增產(chǎn)物的產(chǎn)量和引物的特異性，最終選擇55℃作為該對(duì)引物的退火溫度。以內(nèi)引物CTNS/CTNA進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)，不同退火溫度下擴(kuò)增N.parvum基因組DNA的結(jié)果見圖2，結(jié)果表明該對(duì)引物在退火溫度45～55℃均能擴(kuò)增出目的條帶，但均有非目的性條帶產(chǎn)生。為了使引物的特異性最佳，最終選擇53℃作為該對(duì)引物的退火溫度。

2.2 巢式PCR特異性檢測(cè)

外引物對(duì)CTWK3S/CTWK3A常規(guī)PCR擴(kuò)增結(jié)果見圖3，5個(gè)不同來源的N.parvum均擴(kuò)增出了非常明亮的271 bp的目的條帶，但其他菌株也都有微弱非特異性目的條帶出現(xiàn)。內(nèi)引物對(duì)CTNS/CTNA常規(guī)PCR擴(kuò)增結(jié)果見圖4，5個(gè)不同來源的N.parvum均擴(kuò)增出了不甚明亮的97 bp的目的條帶，但葡萄座腔菌屬Botryosphaeria的3個(gè)菌株（圖4，泳道6～8）可見一條約500 bp的微弱非特異性目的條帶，其他10個(gè)菌株均無條帶出現(xiàn)。巢式PCR檢測(cè)結(jié)果見圖5，5個(gè)不同來源的N.parvum均擴(kuò)增出了97 bp的特異性目的條帶，而其他18個(gè)菌株均無條帶出現(xiàn)。

2.3 巢式PCR靈敏度檢測(cè)

用內(nèi)側(cè)特異性引物對(duì)CTNS/CTNA進(jìn)行常規(guī)PCR，能檢測(cè)到300 fg/μL的N.parvum總DNA（圖6），而用外側(cè)引物對(duì)CTWK3S/CTWK3A的PCR產(chǎn)物稀釋10倍作為模板，再用內(nèi)引物對(duì)CTNS/CTNA進(jìn)行巢式PCR能檢測(cè)到30 fg/μL的N.parvum總DNA（圖7）。表明巢式PCR靈敏度是常規(guī)PCR的10倍。

2.4 測(cè)序結(jié)果

陽性產(chǎn)物克隆測(cè)序后在NCBI數(shù)據(jù)庫進(jìn)行在線BLAST對(duì)比分析，結(jié)果表明，本試驗(yàn)選取的3個(gè)陽性克隆的序列與N.parvum CMW9071菌株（GenBank登錄號(hào)為EU339498.1）、MUCC211菌株（GenBank登錄號(hào)為EU339500.1）和CMW7772菌株（GenBank登錄號(hào)為EU339495.1）的序列一致性達(dá)100%，100%和99%，用DNAMAN軟件包分析比對(duì)表明，序列與巢式PCR預(yù)測(cè)產(chǎn)物一致。

2.5 核桃發(fā)病組織檢測(cè)

不同發(fā)病情況的組織及健康組織DNA分別以CTWK3S/CTWK3A和CTNS/CTNA進(jìn)行常規(guī)PCR檢測(cè)和巢式PCR檢測(cè)，結(jié)果見圖8。兩對(duì)引物的常規(guī)PCR均只能檢測(cè)出3級(jí)、2級(jí)和1級(jí)發(fā)病組織內(nèi)病原菌，其中CTWK3S/CTWK3A還擴(kuò)增出了約850 bp的明顯雜帶，而巢式PCR可以檢測(cè)出4級(jí)、3級(jí)、2級(jí)、1級(jí)和0級(jí)發(fā)病組織，且呈單一條帶，表明其靈敏度和特異性都明顯高于常規(guī)PCR。

3 討論

一種高特異性、高靈敏度的分子檢測(cè)方法能否成功建立，關(guān)鍵在于靶序列的選擇。目前，已報(bào)道的分子檢測(cè)技術(shù)常用靶序列主要有核糖體RNA基因的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）[22]、細(xì)胞骨架蛋白（betatubulin）基因[23]、肌動(dòng)蛋白（actin）[24]基因、水稻抗稻瘟病基因（Pi）[25]、轉(zhuǎn)錄延伸因子（factor 1alpha）[26]、 熱激蛋白（heat shock protein）基因[27]、線粒體NADH脫氫酶基因（NADH 1）[28]、RNA聚合酶Ⅱ第2大亞基基因（RPB2）[29]等。眾所周知，不同物種的基因保守序列不同，同一物種的同一基因變異程度也不同，而植物病原菌作為典型的R策略者，其種群增長(zhǎng)率大，種內(nèi)遺傳多樣性豐富，所以尋找一個(gè)合適的分子檢測(cè)靶基因并不是一件輕而易舉的事。

幾丁質(zhì)合酶是促成幾丁質(zhì)分子延長(zhǎng)的酶，而CHS1的主要作用則是在細(xì)胞分裂中合成幾丁質(zhì)。該基因在植物病原檢測(cè)中還未見報(bào)道，但曾在動(dòng)物皮膚病病原分子檢測(cè)中有作為靶基因的報(bào)道，如李曉紅等[30]基于申克孢子絲菌的CHS1基因建立了孢子絲菌病PCR分子檢測(cè)方法。

N.parvum導(dǎo)致的核桃枝枯病在韓國(guó)以及我國(guó)山西和四川有發(fā)生[1113]。本試驗(yàn)雖選擇了5個(gè)不同來源的N.parvum菌株進(jìn)行了巢式PCR分子檢測(cè)技術(shù)的研究，但由于病原菌種群內(nèi)遺傳多樣性較豐富，所以該技術(shù)是否能夠成功檢測(cè)其他更多來源的病原菌還有待下一步驗(yàn)證。

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