利用雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法檢測刺萼龍葵SrDOG1基因的表達(dá)

王新果　趙丹丹　黃紅娟　黃兆峰　陳景超　王慧敏　張朝賢　魏守輝

摘要

雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法是基因表達(dá)定量研究中應(yīng)用較廣的一種相對定量檢測方法。本研究結(jié)合絕對定量的原理，對傳統(tǒng)雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法進(jìn)行了改進(jìn)。以刺萼龍葵延遲萌發(fā)基因DELAY OF GERMINATION 1 （DOG1）的表達(dá)檢測為例，選擇βactin為內(nèi)參基因，分別將目的基因和內(nèi)參基因片段插入pEASYBlunt Zero載體，制作標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒。提取冷藏或常溫儲藏種子的RNA進(jìn)行熒光擴增，同時將標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒梯度稀釋液作為模板構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線，以此計算SrDOG1的相對表達(dá)量。結(jié)果表明，雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法能夠靈敏地檢測SrDOG1基因的差異表達(dá)，發(fā)現(xiàn)冷藏種子中SrDOG1基因的表達(dá)量較常溫儲藏顯著增高。雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法檢測結(jié)果穩(wěn)定，重現(xiàn)性好，數(shù)據(jù)處理簡單，適用于多種條件下基因表達(dá)水平的比較，為進(jìn)一步系統(tǒng)研究刺萼龍葵DOG1基因的表達(dá)特性和基因功能奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞

雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法； 刺萼龍葵； DOG1基因； 相對定量； 表達(dá)檢測

中圖分類號：

Q786

文獻(xiàn)標(biāo)識碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2017119

Detection of DOG1 gene expression in Solanum rostratum by

double standard curve method

WANG Xinguo， ZHAO Dandan， HUANG Hongjuan， HUANG Zhaofeng，

CHEN Jingchao， WANG Huimin， ZHANG Chaoxian， WEI Shouhui

（Institute of Plant Protection， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Beijing 100193， China）

Abstract

Double standard curve method is a relative quantification method widely used in quantitative detection of gene expressions. Combined with the principle and method of absolute quantification， the traditional double standard curve method was improved. The fragment of target gene DELAY OF GERMINATION 1 （SrDOG1） and reference gene βactin （SrACT） were cloned into pEASYBlunt Zero vector to make the standard plasmid， respectively. The total RNA were extracted from Solanum rostratum seeds and the standard curves were achieved by realtime PCR reaction using the dilutions of standard plasmid as the template. According to the standard curve， the relative expression of SrDOG1 was obtained. The results showed that SrDOG1 transcript level in seeds under cold storage was significantly higher than that under room temperature， suggesting that double standard curve method has high sensitivity in quantification of expression differences of DOG1 gene. This method is stable， reproducible and simple in data processing. It is suitable for the comparison of relative gene expression levels under various conditions and is useful to further determine the gene expression and gene function of SrDOG1 in the future.

Key words

double standard curve； Solanum rostratum； DOG1； relative quantification； expression detection

基因表達(dá)水平的檢測方法大致可分為絕對定量和相對定量兩類[14]。絕對定量是樣本中某基因的具體表達(dá)量，而相對定量是相對某一參照的表達(dá)水平。相對定量又分為2-ΔΔCT法和雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法[510]。相較于2-ΔΔCT法，雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法計算簡單，對引物的擴增效率沒有嚴(yán)格的要求。但傳統(tǒng)的雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法得到的目的基因相對于內(nèi)參基因的表達(dá)量并不能反映樣本中真實的表達(dá)水平，必須設(shè)定對照組，結(jié)果表示為未知樣本相對于對照樣本表達(dá)量的倍數(shù)[1112]。因此，在處理較多的試驗中，可能由于無法選擇相同的對照組而導(dǎo)致無法對不同處理的結(jié)果進(jìn)行比較。通過結(jié)合絕對定量的方法及原理，對傳統(tǒng)的雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法嚴(yán)格規(guī)范，可無需設(shè)定對照組，直接檢測未知樣本中目的基因相對內(nèi)參基因的真實表達(dá)水平，能夠更加直觀地得出多個處理之間的表達(dá)差異。

刺萼龍葵Solanum rostratum Dunal是一年生茄科茄屬入侵雜草，是一種高度危險的檢疫性有害生物，嚴(yán)重影響其入侵地的生態(tài)多樣性[1315]。刺萼龍葵具有極強的入侵性，我國已先后在遼寧、吉林、河北、北京、山西、內(nèi)蒙古及新疆等地發(fā)現(xiàn)其擴散蔓延[1618]。刺萼龍葵主要由種子進(jìn)行傳播，降低刺萼龍葵種源基數(shù)，可以有效地控制其危害蔓延[1920]。刺萼龍葵種子具有極強的休眠特性，而DOG1（DELAY OF GERMINATION 1）基因是種子休眠特異相關(guān)基因[2122]。建立穩(wěn)定、可靠的刺萼龍葵DOG1基因表達(dá)的定量檢測方法，有利于今后深入研究SrDOG1基因的時空表達(dá)特性和基因功能。

1 材料與方法

1.1 引物設(shè)計

以βactin基因為內(nèi)參基因，根據(jù)刺萼龍葵SrDOG1和βactin（SrACT）基因序列，采用Oligo 7與Primer 6等軟件分別設(shè)計用于克隆及熒光定量PCR的引物，引物由北京六合華大基因科技股份有限公司合成。具體引物序列見表1。

1.2 質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制備

分別擴增目的基因和內(nèi)參基因片段，產(chǎn)物純化回收后連接至pEASYBlunt Zero載體，并轉(zhuǎn)入大腸桿菌中擴繁，之后使用菌液PCR進(jìn)行驗證，篩選出的陽性克隆送至北京六合華大基因科技股份有限公司測序。分析測序結(jié)果，從測序合格的菌液中提取質(zhì)粒并純化，凝膠電泳及微量紫外分光光度計檢測質(zhì)粒的純度和濃度。合格的質(zhì)粒溶液OD260/OD280在1.8左右，OD260/OD230在2.2左右。根據(jù)質(zhì)?？截悢?shù)（copies/μL）=6.02×1023（copies/mol）×質(zhì)粒濃度（g/μL）/質(zhì)粒分子量（g/mol）得出各質(zhì)?？截悢?shù)濃度，之后稀釋拷貝數(shù)濃度至107 copies/μL左右作為熒光定量PCR反應(yīng)的模板[2124]。

1.3 RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄

分別取25～35粒常溫儲藏和冷藏的刺萼龍葵種子，參考植物總RNA提取試劑盒的操作步驟，提取種子總RNA，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳及紫外分光光度計檢測合格后，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA備用。合格的RNA在電泳膠圖中應(yīng)無DNA雜帶，OD260/OD280在1.8～2.0之間，OD260/OD230在2.0以上。

1.4 引物及質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品擴增效率的熒光驗證

引物驗證以cDNA為模板，將其進(jìn)行3倍梯度稀釋后進(jìn)行熒光定量PCR，得到目的基因與內(nèi)參基因熒光引物的標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)曲線的擴增效率、決定系數(shù)以及熔解曲線，確定熒光引物的可用性。熒光PCR反應(yīng)體系：SYBR Green I熒光染料12.5 μL，上、下游引物各1 μL，模板1 μL，補ddH2O至25 μL。熒光定量PCR反應(yīng)條件：95℃ 15 min；95℃ 15 s，60℃ 1 min，40個循環(huán)；從60℃連續(xù)遞增到 95℃，收集熒光信號獲取熔解曲線，以確定 PCR反應(yīng)的特異性。每個梯度的樣品在同一個96孔板上做3次技術(shù)重復(fù)，并用無菌水代替模板作為對照。質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的驗證過程同引物基本一致，僅模板不同，模板更改為梯度稀釋的質(zhì)粒。兩次檢測的擴增效率均需達(dá)90%～110%，決定系數(shù)0.990以上。

1.5 基因表達(dá)檢測方法及數(shù)據(jù)處理

將含有目的基因和內(nèi)參基因的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品與待測樣本（常溫儲藏和冷藏的種子總RNA）在同一96孔板上進(jìn)行實時熒光定量PCR反應(yīng)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行3倍梯度稀釋作為定量反應(yīng)模板。未知樣本分別檢測目的及內(nèi)參基因的表達(dá)水平，每個樣本設(shè)3個生物學(xué)重復(fù)，每個處理設(shè)3個技術(shù)重復(fù)，以無菌水為對照。根據(jù)目的和內(nèi)參基因質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)曲線獲取基因的拷貝數(shù)含量，通過內(nèi)參基因的均一化處理，即可知未知樣本中目的基因相對于內(nèi)參基因的表達(dá)量。數(shù)據(jù)使用SPSS軟件進(jìn)行方差分析（鄧肯法，α=0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)粒提取及濃度檢測

經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計檢測，目的及內(nèi)參基因質(zhì)粒的提取較為完整，無雜質(zhì)條帶（圖1），且各質(zhì)粒溶液濃度較高，OD260/OD280均在1.8～2.0之間，OD260/OD230基本大于2.0（表2）。可作為標(biāo)準(zhǔn)品構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.2 引物及質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的熒光檢測

通過梯度熒光定量PCR，利用軟件分析，得到引物在以cDNA為模板時的標(biāo)準(zhǔn)曲線以及熔解曲線（圖2）。結(jié)果表明，試驗設(shè)計的引物均較為理想，SrDOG1引物的擴增效率為104.78%，決定系數(shù)為0.997，熔解曲線單峰，無非特異性產(chǎn)物；SrACT引物的擴增效率為100.13%，決定系數(shù)為0.999，熔解曲線單峰，無非特異性產(chǎn)物。

使用同樣的方法，可得目的基因及內(nèi)參基因質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線及熔解曲線（圖3）。目的基因質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的擴增效率為103.87%，決定系數(shù)為0.999，內(nèi)參基因質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的擴增效率為96.23%，決定系數(shù)為0.999。各質(zhì)粒的熔解曲線均為單峰，反應(yīng)均無非特異性產(chǎn)物。

2.3 SrDOG1基因的表達(dá)量檢測

分別測定刺萼龍葵種子在常溫和低溫儲藏條件下SrDOG1基因的相對表達(dá)量，結(jié)果表明，低溫貯藏條件下種子中SrDOG1基因的表達(dá)水平是常溫貯藏條件下的2.28倍，兩者間差異達(dá)到顯著水平（圖4）。這一結(jié)果與前人對DOG1基因的表達(dá)特性研究較為一致，說明雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法可以檢測出SrDOG1基因在不同條件下的表達(dá)差異。從具體檢測數(shù)據(jù)上看，低溫條件下SrDOG1基因的表達(dá)量是內(nèi)參基因SrACT的0.919倍，數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)誤為0.122、變異系數(shù)為22.9%，在置信度0.95下其置信區(qū)間為0.680～1.157；而在常溫儲藏條件下，SrDOG1基因的表達(dá)量是SrACT的0.403倍，標(biāo)準(zhǔn)誤為0.040、變異系數(shù)為17.4%，在置信度為0.95下其置信區(qū)間為0.323～0.482。上述結(jié)果表明，雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法檢測穩(wěn)定性強、重復(fù)性好，結(jié)果較為可靠，檢測精度較高，適用于刺萼龍葵SrDOG1基因表達(dá)水平的檢測。

3 討論

實時熒光定量是一種特異性強、靈敏度高、重復(fù)性好的核酸定量分析技術(shù)，具有快速、準(zhǔn)確、簡便等優(yōu)點[2527]。對于處理較多的研究，傳統(tǒng)熒光定量由于參照設(shè)置的差異而難以對結(jié)果進(jìn)行不同維度的比較。雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法的相對定量檢測通過優(yōu)化絕對定量的方法，對引物、質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品、標(biāo)準(zhǔn)曲線等進(jìn)行嚴(yán)格規(guī)范，基因表達(dá)水平可以簡單地以目的基因為內(nèi)參基因的倍數(shù)表示，因而能夠比較多處理間目的基因的表達(dá)水平差異[22，28]。

應(yīng)用雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法對刺萼龍葵種子中延遲萌發(fā)基因DOG1的表達(dá)進(jìn)行了檢測，結(jié)果顯示，該方法檢測結(jié)果穩(wěn)定、直觀、重現(xiàn)性好，數(shù)據(jù)對比方便快捷，可以靈敏地檢測出DOG1基因在不同條件下的表達(dá)差異，為進(jìn)一步研究DOG1基因的表達(dá)特性及功能奠定了方法基礎(chǔ)。

DOG1基因是調(diào)控種子休眠的特異相關(guān)基因，通常在發(fā)育或成熟的種子中表達(dá)[2122]。種子的休眠程度與DOG1蛋白水平高度相關(guān)，DOG1的表達(dá)水平越高，種子休眠程度越深，DOG1的表達(dá)水平可以反映種子的休眠程度[1]。本研究檢測發(fā)現(xiàn)，刺萼龍葵低溫儲藏種子中DOG1基因的相對表達(dá)量幾乎是常溫儲藏條件下的兩倍，說明低溫環(huán)境對DOG1基因的表達(dá)及種子休眠有顯著影響。前人也認(rèn)為DOG1基因可能是種子的環(huán)境信號感受器，可通過感知溫度、水分或光照等環(huán)境信號，使種子在不同季節(jié)對環(huán)境做出不同的響應(yīng)，調(diào)控開啟種子萌發(fā)的適宜時間窗口[22，2930]。

雜草種子休眠的進(jìn)化趨勢是將種子萌發(fā)延遲到適于幼苗生長的季節(jié)，萌發(fā)時機的調(diào)節(jié)是雜草適應(yīng)自然和農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)的重要性狀。目前，延遲萌發(fā)基因DOG1的具體功能和調(diào)控通路尚不明確，通過建立雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法的熒光定量檢測技術(shù)，系統(tǒng)研究DOG1基因的表達(dá)特性和時空特征、季節(jié)性休眠過程中種子萌發(fā)與DOG1基因表達(dá)水平的相關(guān)性、DOG1基因?qū)Νh(huán)境因子信號的響應(yīng)模式及與ABA和GA等激素信號通路的互作機理，有望深入揭示DOG1基因調(diào)控種子休眠的分子機制。

參考文獻(xiàn)

[1] NAKABAYASHI K， BARTSCH M， XIANG Yong， et al. The time required for dormancy release in Arabidopsis is determined by delay of germination 1 protein levels in freshly harvested seeds [J]. Plant Cell， 2012， 24（7）： 28262838.

[2] CHAN Chichao， CHEW E Y， SHEN Defen， et al. Expression of stem cells markers in ocular hemangioblastoma associated with von HippelLindau （VHL） disease [J]. Molecular Vision， 2011， 11： 697.

[3] 克丙申，黃象艷，陳世敏，等.PCR擴增試驗的動力學(xué)數(shù)學(xué)模型[J].遺傳，2002，24（1）： 5559.

[4] 王行， 王惠民. 實時定量PCR技術(shù)的方法學(xué)分類[J].臨床檢驗雜志， 2007， 25（1）： 7172.

[5] PARK D M， ZHUANG Zhengping， CHEN Ling， et al. von HippelLindau diseaseassociated hemangioblastomas are derived from embryologic multipotent cells [J]. PLoS Medicine， 2007， 4（2）： e60.

[6] ZHOU Min， SHEN Defen， HEAD J E， et al. Ocular clusterin expression in von HippelLindau disease [J]. Molecular Vision， 2007， 13： 21292136.

[7] MOSONI P， CHAUCHEYRASDURAND F， BRAMAILLET C， et al. Quantification by realtime PCR of cellulolytic bacteria in the rumen of sheep after supplementation of a forage diet with readily fermentable carbohydrates： effect of a yeast additive [J].Journal of Applied Microbiology，2007，103（6）：26762685.

[8] YU Lili， ZHANG Wenliang， LIU Tianju， et al. Global gene expression of Trichophyton rubrum in response to PH11B， a novel fatty acid synthase inhibitor [J]. Journal of Applied Microbiology， 2007， 103（6）： 23462352.

[9] LIU Weihong， SAINT D A. Validation of a quantitative method for real time PCR kinetics [J]. Biochemical & Biophysical Research Communications， 2002， 294（2）： 347353.

[10]LIVAK K J， SCHMITTGEN T D.Analysis of relative gene expression data using realtime quantitative PCR and the 2-ΔΔCT method [J]. Methods， 2001， 25（4）： 402408.

[11]徐麗華，劉春雷， 常玉梅， 等. 雙標(biāo)準(zhǔn)曲線相對定量PCR試驗原理與方法[J]. 生物技術(shù)通報， 2011， 1： 7075.

[12]張吉宇， 王彥榮， 南志標(biāo). 相對定量和絕對定量——以CsSAMDC基因表達(dá)分析為例[J]. 中國生物工程雜志， 2009， 29（8）： 8691.

[13]高芳， 徐馳.潛在危險性外來物種——刺萼龍葵[J].生物學(xué)通報， 2005，40（9）： 1112.

[14]高芳， 徐馳， 周云龍.外來植物刺萼龍葵潛在危險性評估及其防治對策[J]. 北京師范大學(xué)學(xué)報， 2005， 41（4）： 420424.

[15]魏守輝， 張朝賢， 劉延，等.外來雜草刺萼龍葵及其風(fēng)險評估[J]. 中國農(nóng)學(xué)通報， 2007，23（3）： 347351.

[16]林玉， 譚敦炎.一種潛在的外來入侵植物：黃花刺茄[J]. 植物分類學(xué)報， 2007， 45（5）： 675685.

[17]賀俊英， 哈斯巴根， 孟根其其格， 等.內(nèi)蒙古新外來入侵植物—黃花刺茄 （Solanum rostratum Dunal）[J]. 內(nèi)蒙古師范大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)漢文版）， 2011， 40： 288290.

[18]向俊， 李翠妮， 劉全儒， 等.北京外來入侵植物刺萼龍葵的生態(tài)狀況[J]. 生態(tài)學(xué)雜志， 2011， 30（3）： 453458.

[19]BUHLER D D， HARTZLER R G， FORCELLA F. Implications of weed seedbank dynamics to weed management[J]. Weed Science， 1997， 45： 329336.

[20]魏守輝， 強勝， 馬波， 等.土壤雜草種子庫與雜草綜合管理[J].土壤， 2005， 37（2）： 121128.

[21]BENTSINK L， JOWETT J， HANHART C J， et al. Cloning of DOG1， a quantitative trait locus controlling seed dormancy in Arabidopsis [J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America， 2006， 103（45）： 1704217047.

[22]CHIANG G C K， BARTSCH M， BARUA D， et al. DOG1 expression is predicted by the seedmaturation environment and contributes to geographical variation in germination in Arabidopsis thaliana [J]. Molecular Ecology， 2011， 20（16）： 33363349.

[23]李麗， 趙成萍， 李宏，等. 質(zhì)粒制備絕對定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線方法的建立[J]. 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報， 2011， 19（6）： 11571162.

[24]李慧鋒， 李麗， 張麗娟，等. PepT1基因絕對熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立[J]. 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版）， 2010， 30（4）： 332335.

[25]DI M E， CANGEMI G， FILIPPETTI M， et al. Development and clinical validation of a realtime PCR using a unimolecular scorpionbased probe for the detection of Mycoplasma pneumoniae in clinical isolates [J]. The New Microbiologica， 2007， 30（4）： 415421.

[26]MORSCZECK C， KORENKOV M， NAGELSCHMIDT M， et al. Total RNAisolation of abdominal hernia of rats for quantitative realtime reverse transcription （RT） PCR assays [J]. Preparative Biochemistry & Biotechnology， 2008， 38（1）： 8793.

[27]SOBAJIMA S， SHIMER A L， CHADDERDON R C， et al. Quantitative analysis of gene expression in a rabbit model of intervertebral disc degeneration by realtime polymerase chain reaction[J].The Spine Journal， 2005， 5（1）： 1423.

[28]張馳宇， 徐順高， 黃新祥. 一種新穎簡便的熒光實時RTPCR相對定量方法的建立[J]. 生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展， 2005， 32（9）： 883888.

[29]FOOTITT S， DOUTERELOSOLER I， CLAY H， et al. Dormancy cycling in Arabidopsis seeds is controlled by seasonally distinct hormonesignaling pathways [J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America， 2011， 108（50）： 2023620241.

[30]FOOTITT S， MLLER K， KERMODE A R， et al. Seed dormancy cycling in Arabidopsis： chromatin remodelling and regulation of DOG1 in response to seasonal environmental signals [J]. Plant Journal， 2015， 81（3）： 413425.

（責(zé)任編輯：楊明麗）