葡萄卷葉伴隨病毒1號和3號寧夏分離物部分基因序列分析

呂苗苗　李文學　孫牧笛　胡麗杰　顧沛雯

摘要

為明確葡萄卷葉伴隨病毒（GLRaVs）在寧夏賀蘭山東麓釀酒葡萄上的侵染狀況，采用RTPCR技術對40份釀酒葡萄樣品中的GLRaV1～GLRaV5進行了外殼蛋白（CP）、復制酶（RdRp）和熱激蛋白（HSP70）基因序列的克隆和分析。檢測結果表明，在所檢測的5種病毒中，除GLRaV2和GLRaV4未檢測到外，GLRaV1和GLRaV3的檢出率最高，分別為20.0%和32.5%，GLRaV5的檢出率僅為5.0%；有6個樣品存在GLRaV1和GLRaV3兩種病毒復合侵染。序列分析表明，GLRaV1寧夏分離物的部分CP基因序列長度為232 nt，其兩種分離物間的核苷酸序列同源率為90%，與已報道的國內外其他分離物CP基因序列相比，其同源率為90%～99%；GLRaV3寧夏分離物的CP基因序列長度為942 nt，其兩種分離物間的核苷酸序列同源率為40%，與已報道的國內外其他分離物CP基因序列相比，其同源率為40%～99%；GLRaV3寧夏分離物的RdRp基因序列長度為683 nt，其各分離物間的核苷酸序列同源率為90%以上，與已報道的國內外其他分離物RdRp基因序列相比，其同源率為90%～99%；GLRaV3寧夏分離物的HSP70基因序列長度為546 nt，其兩種分離物間的核苷酸序列同源率為96%，與已報道的國內外其他分離物HSP70基因序列相比，其同源率為96%～99%。

關鍵詞

葡萄卷葉伴隨病毒（GLRaVs）； RTPCR檢測； 克??； 序列分析

中圖分類號：

S 436.631

文獻標識碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2017187

Sequence analysis of the genes of Grapevine leafrollassociated

viruses 1 and 3 from Ningxia isolates

L Miaomiao， LI Wenxue， SUN Mudi， HU Lijie， GU Peiwen

（College of Agriculture， Ningxia University， Yinchuan 750021， China）

Abstract

To understand the infection status of Grapevine leaf rollassociated virus in wine grapes grown in Helan Mountain East Region of Ningxia， RTPCR was used to clone the coat protein （CP）， replication enzyme （RdRp） and heat shock protein （HSP70） gene sequences of Grapevine leaf rollassociated virus 15 in 40 wine grape samples and gene sequence analysis was conducted. The results showed that the detection rate of GLRaV1 and GLRaV3 in all samples was 20.0% and 32.5%， respectively， but the detection rate of GLRaV5 was only 5.0%； in addition， GLRaV2 and GLRaV4 were not detected in the samples， GLRaV1 and GLRaV3 showed compound infection in six samples. The sequence analysis showed that each partial sequence of GLRaV1CP gene of the two isolates was 232 nt long and their nucleotide sequence homology was 90%， and their nucleotide sequence homology with those of previously reported isolates was 90%-99%. Each of the complete sequence of GLRaV3CP gene of the two isolates was 942 nt long， sharing a nucleotide sequence homology of 40%. Their nucleotide sequence homology with those of previously reported isolates was 40%-99%. Each of the complete sequence of GLRaV3RdRp gene of the three isolates was 683 nt long， sharing a nucleotide sequence homology of 90%， and their nucleotide sequence homology with those of previously reported isolates was 90%-99%. Each of the complete sequence of GLRaV3HSP70 gene of the two isolates was 546 nt long， sharing a nucleotide sequence homology of 96%， and their nucleotide sequence homology with those of previously reported isolates was 96%-99%.

Key words

Grapevine leafrollassociated virus （GLRaVs）； RTPCR detection； cloning； sequence analysis

葡萄卷葉?。╣rapevine leafroll disease，簡稱GLRD）是世界范圍內分布最廣，造成損失最大的一種葡萄病毒病，已成為世界葡萄栽培地區(qū)生產中的嚴重問題。現已研究表明，引起該病的病原是葡萄卷葉伴隨病毒Grapevine leafrollassociated viruses，簡稱GLRaVs，該類病毒目前已查明共有11種，包括GLRaV1～GLRaV9、GLRaVPr和GLRaVDe，這些病毒在血清學和分子生物學上互不相關，單獨或復合侵染葡萄均可導致卷葉病的發(fā)生[1]。

目前，國內發(fā)現至少有10種GLRaVs與該病相關，其中GLRaV1～GLRaV5是造成葡萄卷葉病的主要病原[2]，且復合侵染現象比較普遍[3]。這5種病毒均屬長線形病毒科Closteroviridae，其基因組為正單鏈RNA， GLRaVs全長約12～19 kb，由8～13個開放閱讀框（ORF）組成，其中GLRaV1基因組和GLRaV3基因組分別包括10個主要的ORF和13個ORF，主要編碼類木瓜蛋白酶（PPro）、甲基轉移酶（MTR）、螺旋酶（HEL）、復制酶（RdRp）、熱激蛋白（HSP70）、外殼蛋白（CP）和重復的外殼蛋白（CPd）及幾種功能未知的蛋白。由于在葡萄樹中病毒含量通常較低，因此靈敏度高、特異性強的逆轉錄聚合酶鏈式反應（reverse transcription polymerase chain reaction，簡寫RTPCR）在這幾種病毒檢測中應用廣泛。

寧夏賀蘭山東麓是國內公認的種植釀酒葡萄的最佳生態(tài)區(qū)，近年來，由于葡萄種植新區(qū)的建立和栽培面積的擴大，葡萄品種繁殖材料在各地的引進和輸出也日益頻繁，造成葡萄卷葉病危害猖獗。2015年，在賀蘭山東麓的新牛和新惠彬酒莊葡萄園中，‘蛇龍珠品種葡萄卷葉病田間自然發(fā)病率分別達85.1%和52.7%，個別果園發(fā)病率甚至達到100%[4]。因此，本研究借鑒了國內外有關GLRaVs在CP、RdRp、HSP70基因克隆和序列分析方面的研究結果，進行寧夏GLRaVs分離物的分子檢測和序列比對分析，目的是評判寧夏賀蘭山東麓釀酒葡萄的健康狀況，為減少GLRaVs在該區(qū)域的傳播和蔓延提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 材料

參試釀酒葡萄品種材料來自賀蘭山東麓8個主要的葡萄產地，分別為寧夏永寧縣玉泉營農產新惠彬酒莊、農墾東大灘釀酒葡萄基地、農墾南大灘釀酒葡萄基地和閩寧鎮(zhèn)立蘭酒莊；銀川市金鳳區(qū)廣夏三基地和森淼蘭月谷酒莊；銀川市西夏區(qū)新牛酒莊和志輝源石酒莊。

供試品種為‘赤霞珠（‘Cabernet Sauvignon）、‘蛇龍珠（‘Cabernet Gernischt）、‘黑比諾（‘Pinot Noir）、‘霞多麗（‘Chardonnay）、‘品麗珠（‘Cabernet Franc）、‘美樂（‘Merlot）、‘西拉（‘Shiraz）和‘威代爾（‘Vidal）。

1.2 采樣方法

采集樣品在釀酒葡萄栽培園和葡萄品種園進行。隨機選擇單株，每個單株剪取6～10片葉及5～10個枝條，嫩葉片采集于樹體上部枝條第3～5節(jié)上，老葉片采集于下部枝條第5節(jié)以后；嫩枝條采集于未木質化的上部新梢，老枝條采集于下部已木質化的枝條；嫩葉柄為嫩葉片的葉柄，老葉柄為老葉的葉柄。將樣品立即用錫箔紙包好，注明采集日期、地點、品種、品種來源、種植面積等，置于液氮罐中，室內于-80℃冰箱中保存，備用。

1.3 GLRaVs分子檢測

1.3.1 引物序列

根據文獻[510]，設計GLRaV1～GLRaV5的特異性引物，引物序列如表1。

1.3.2 RNA提取

稱取葡萄葉柄、枝條韌皮部組織100 mg，加入液氮迅速研磨至粉末狀，并將粉末轉移到1.5 mL的離心管中，按照OMEGA提取RNA試劑盒（美國OMEGA公司）使用說明書進行總RNA的提取。

1.3.3 RTPCR檢測

提取出的總RNA采用反轉錄試劑盒（北京全式金生物有限公司）反轉錄成cDNA，每個反應體系為20 μL，先加入總RNA 4 μL、OligDT18Primer 1 μL、RNasefree Water 3 μL置于65℃溫浴5 min，取出冰浴2 min；再加入2×TS Reaction Mix 10 μL、TransScriptTMRT 1 μL、gDNA Remover 1 μL，輕輕混勻，于42℃孵育30 min，之后經85℃加熱5 s，失活TransScriptTMRT和gDNA Remover，即可得到所需的cDNA。

采用設計的特異性引物GLRaV1～GLRaV5對樣品中病毒進行檢測。PCR擴增反應體系25 μL：總DNA 2 μL，正向、反向引物各2 μL，Max Taq酶25 μL，RNasefree Water 18 μL；PCR擴增條件：94℃ 3 min，94℃ 1 min，55℃ 45 s，72℃ 1 min，35個循環(huán)，72℃ 10 min。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測產物。PCR產物由武漢昆泰公司進行測序。

1.4 GLRaV1和GLRaV3寧夏分離物部分基因組的系統(tǒng)進化分析

從GenBank中獲得4個不同地理來源的GLRaV1分離株CP基因序列，分別為中國遼寧分離物GSITRI1（KP067351）和BJMuH（KP067359）、美國分離物CA22（JF811849）和加拿大分離物WC429（EF103902）；5個不同地理來源的GLRaV3分離株CP基因序列，分別為中國北京分離物YN1（KC477181）、四川分離物SL10（DQ911148）和湖北分離物Dawanhong NO.2（DQ119574）、美國分離物WAMR（GU983863）和智利分離物TRAJBR（KX756669）。4個不同地理來源的GLRaV3分離株RdRp基因序列，分別為中國北京分離物LN（JQ423939）、湖北分離物GLRaV3AYHB（AY495340）、意大利分離物CN4151（GU812895）和南非分離物621（GQ352631）；4個不同地理來源的GLRaV3分離株HSP70基因序列，分別為中國遼寧分離物GLRaV3GQLN（GQ246623）和L1（GQ478313）、美國分離物VAFL049（KF417602）和智利分離物4262LR3（HM636879）。小櫻桃病毒Little cherry virus（簡稱LChV）作為同屬的外組病毒，分別為法國分離物PR2910（KT347315）、波蘭分離物C14（EU153101）、美國分離物Jeju63（KP410831）和美國分離物LChVAYMG（AY944067）。

利用DNAMAN5.2.2軟件進行多重比對（Clustal W方法），分析不同分離株間的核酸序列相似性。鄰接法（設定1 000重復值的bootstrap評估遺傳距離分支的可信度）構建不同地理起源分離株的系統(tǒng)進化樹。

2 結果與分析

2.1 總RNA質量及RTPCR檢測結果

由圖1a可知，釀酒葡萄總RNA有兩條清晰明亮帶，分別為28S rRNA和18S rRNA。紫外分光光度計測得OD260/OD280比值約為2.15，表明所提取的總RNA完整性和純度較好。以此為模板，采用RTPCR分別檢測GLRaV1～GLRaV5的CP基因序列與GLRaV3的HSP70和RdRp基因序列。結果表明，GLRaV1部分CP基因和GLRaV3的CP基因擴增產物條帶片段大小分別為230 bp和940 bp左右，與預期的GLRaV1和GLRaV3的CP基因序列大小相符（圖1b和c），初步定名為GLRaV1CPNX和GLRaV3CPNX（寧夏分離物）。采用GLRaV3的HSP70和RdRp基因特異性引物對寧夏分離物進行RTPCR檢測，獲得的擴增產物片段大小分別為540 bp和680 bp左右，與預期的GLRaV3的HSP70和RdRp基因序列大小相符（圖1d和e），且檢測結果與GLRaV3的CP基因陽性率一致。初步定名為GLRaV3HSP70NX和GLRaV3RdRpNX（寧夏分離物）。GLRaV5的CP基因擴增產物條帶片段大小為690 bp左右，與預期的GLRaV5的CP基因序列大小相符（圖1f），初步定名為GLRaV5CPNX（寧夏分離物）。

2.2 GLRaV1CPNX核苷酸序列的分析比較

將8個GLRaV1寧夏分離物的CP基因的核苷酸序列與NCBI中注冊的序列進行同源性比對，發(fā)現共有2種不同的寧夏分離物GLRaV1CPNX，CP基因序列長度均為232 nt，分別定名為GLRaV1CPNX1和GLRaV1CPNX2，其比例為3∶1。根據已報道的4個不同地理來源的GLRaV1CP序列作為參照，建立系統(tǒng)進化樹。

由圖2可知，兩種寧夏分離物GLRaV1CPNX1和GLRaV1CPNX2的核苷酸序列相似性為90%，分別聚在2個分支中，其中GLRaV1CPNX1與中國遼寧分離物GSITRI1（KP067351）序列相似性最高，為99%，其次與美國分離物CA22（JF811849）的相似性為97%；與加拿大分離物WC429（EF103902）的相似性95%。寧夏分離物GLRaV1CPNX2與中國遼寧另一分離物BJMuH（KP067359）的相似性較高，為99%，而與美國分離物CA22（JF811849）和加拿大分離物WC429（EF103902）和中國遼寧分離物GSITRI1（KP067351）的相似性較低，分別為92%、91%和90%。2個GLRaV1寧夏分離物CP基因序列與小櫻桃病毒法國分離物PR2910（KT347315）的相似性均存在較大差異，一致性均為40%。說明GLRaV1寧夏分離物存在著分子變異，在寧夏至少存在2株變異株系。

2.3 GLRaV3CP（RdRp和HSP70）NX核苷酸序列的分析比較

將13個GLRaV3寧夏分離物的CP、RdRp和HSP70基因的核苷酸序列與NCBI中的同源序列進行比對，發(fā)現共存在2種不同的CP基因序列，分別定名為GLRaV3CPNX1和GLRaV3CPNX2，GLRaV3 CP基因序列長度均為942 nt；3種不同的RdRp基因序列，分別定名為GLRaV3RdRpNX1、GLRaV3RdRpNX2和GLRaV3RdRpNX3，GLRaV3 RdRp基因序列長度均為683 nt；2種不同的HSP70基因序列，分別定名為GLRaV3HSP70NX1和GLRaV3HSP70NX2，GLRaV3 HSP70基因序列長度均為546 nt。根據已報道的不同地理來源的GLRaV3的CP、RdRp和HSP70基因序列作為參照，建立系統(tǒng)進化樹。

由圖3a可知，GLRaV3CPNX1和GLRaV3CPNX2的核苷酸序列相似性為40%，分別聚在2個分支中，其中GLRaV3CPNX1與國內的北京分離物YN1（KC477181）、四川分離物SL10（DQ911148）和湖北分離物Dawanhong NO.2（DQ119574）及國外的美國分離物WAMR（GU983863）、智利分離物TRAJBR（KX756669）的相似性達到99%。而GLRaV3CPNX2與國內外的分離物的一致性均較低，僅為40%。GLRaV3CPNX1和GLRaV3CPNX2均與小櫻桃病毒波蘭分離物C14（EU153101）存在較大差異，相似性分別為46%和40%。

由圖3b可知，GLRaV3RdRpNX1、GLRaV3RdRpNX2和GLRaV3RdRpNX3的核苷酸序列相似性為90%以上，分別聚在3個分支中，其中GLRaV3RdRpNX1與GLRaV3RdRpNX2的相似性較高，為96%，與GLRaV3RdRpNX3的相似性較低，為93%。GLRaV3RdRpNX1與國內湖北分離物GLRaV3AYHB（AY495340）和南非分離物621（GQ352631）的相似性較高，為98%，與意大利分離物CN4151（GU812895）和北京分離物LN（JQ423939）的相似性分別為93%和90%。GLRaV3RdRpNX2與北京分離物LN（JQ423939）的相似性為90%，與其他分離物的相似性均在96%左右。GLRaV3RdRpNX3與意大利分離物CN4151（GU812895）的相似性較高，為98%，與其余國內外分離物的相似性均在94%左右。而3個GLRaV3寧夏分離物RdRp基因序列與小櫻桃病毒美國分離物Anning26（HQ412772）均存在較大差異，相似性均為40%。

由圖3c可知，GLRaV3HSP70NX1和GLRaV3HSP70NX2的核苷酸序列相似性為96%，分別聚在2個分支中，其中GLRaV3HSP70NX1與國內的遼寧分離物GLRaV3GQLN（GQ246623）、L1（GQ478313）和國外的美國分離物VAFL049（KF417602）、智利分離物4262LR3（HM636879）的相似性均達到98%，而GLRaV3HSP70NX2與4種國內外的分離物的相似性為96%左右。2個GLRaV3寧夏分離物HSP70基因序列與小櫻桃病毒美國分離物LChVAYMG（AY944067）均存在較大差異，相似性均為44%。

綜上所述，GLRaV3寧夏分離物的CP、RdRp存在較大的分子變異，推測GLRaV3寧夏分離物可能存在2～3個變異類型。

3 討論

本研究主要對寧夏賀蘭山東麓釀酒葡萄種植區(qū)的5種GLRaVs（GLRaV1～GLRaV5）進行RTPCR檢測。除了GLRaV2和GLRaV4未檢測到外，其余3種GLRaVs均被檢測到，且GLRaV1和GLRaV3的檢測率較高，分別為20.0%和32.5%，說明造成賀蘭山東麓地區(qū)釀酒葡萄出現卷葉病癥狀的主要病原為GLRaV1和GLRaV3。在檢測的40份樣品中，有6份樣品存在GLRaV1和GLRaV3的復合侵染，主要表現在種植18～20年的‘蛇龍珠、‘黑比諾、‘品麗珠、‘赤霞珠和‘霞多麗品種上。由此可見，隨著種植年限的增加，GLRaVs的復合侵染現象越發(fā)的明顯，同時也會引起GLRaVs的分子變異。GLRaVs主要通過苗木調運和接穗的嫁接進行傳播[23]，生產上需要加強引進苗木的葡萄卷葉病的檢測力度，切斷葡萄卷葉病的嫁接傳播途徑，從根本上杜絕葡萄卷葉病的危害。

通過對寧夏分離物GLRaV1CPNX的CP基因的同源性比對，發(fā)現兩種不同的寧夏分離物（GLRaV1CPNX1和GLRaV1CPNX2），分別與遼寧分離物GSITRI1和BJMuH的同源性較高，確定為相同株系。國內外對GLRaV1的CP基因分子變異有一定的研究。2013年Esteves等[24]對葡萄牙的20個GLRaV1分離物的CP基因進行序列分析，證明GLRaV1的CP基因內部存在不同變異株系的基因重組。2015年Fan等[25]對中國43個GLRaV1分離物的CP和HSP70基因進行序列分析，結果顯示大部分突變種與從‘Beta植株上獲得的分離物同屬一組，推測該部分變異種是由攜帶GLRaV1變種的‘Beta砧木嫁接傳播導致的。寧夏釀酒葡萄發(fā)展迅速，據報道在寧夏釀酒葡萄發(fā)展的初期，曾經大量從我國東北地區(qū)引進‘Beta等山葡萄品種作為砧木與歐亞種如‘赤霞珠、‘品麗珠和‘蛇龍珠等進行嫁接，可能經過長期的突變積累，導致GLRaV1不同變異株的復合侵染，通過基因重組在現有栽培上出現了不同的變異株。

本文將GLRaV3寧夏分離物的CP、RdRp和HSP70基因與NCBI中登記的序列進行同源性比對，發(fā)現GLRaV3的CP和RdRp基因序列存在較大的分子變異，可以認為寧夏存在由于CP基因和RdRp基因突變而形成的GLRaV3新的變異株系，其中，GLRaV3CPNX2是由GLRaV1和GLRaV3復合侵染的釀酒葡萄‘蛇龍珠中獲得，該分離物表現出較大的差異性，由此可以推測是一種新的變異種。由于植物病毒本身的RNA聚合酶缺乏嚴密的校對修正功能，使得其在宿主體內形成由一個主序列和與該序列相關的大量突變體集合的病毒種群，稱為準種病毒（quasispecies）。2005年Turturo等[26]研究發(fā)現GLRaV3的不同變異種的復合侵染嚴重，表明結構多樣性的葡萄卷葉病毒種群是準種病毒。2013年Farooq等[27]和Liu等[28]對GLRaV3中國分離物進行多樣性分析，結果顯示CP基因是GLRaV3基因重組較活躍的區(qū)域，不同變異種的基因重組形成了新的變異種。葡萄較長的生長周期、無病毒苗木檢測技術的缺乏、病毒的基因突變以及不同變異株系的復合侵染為基因重組與進化提供了必要的條件。由于我國葡萄病毒病的研究起步較晚，葡萄病毒病原方面的研究較少，而葡萄病毒病對葡萄產業(yè)的影響較大，因此，我們有必要在加強對這些病毒病原研究的同時，加強對葡萄病毒病檢測技術的優(yōu)化和無毒苗木的培育工作，為寧夏釀酒葡萄病毒病的監(jiān)控提供技術支持。

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（責任編輯：田 喆）