LED光源對芽期苦蕎黃酮合成的影響

雒曉鵬，卜星星，趙海霞，李成磊，陳 惠，王安虎，吳 琦，*

（1.四川農(nóng)業(yè)大學生命科學學院，四川 雅安 625014；2.西昌學院農(nóng)業(yè)科學學院，四川 西昌 615000）

LED光源對芽期苦蕎黃酮合成的影響

雒曉鵬1，卜星星1，趙海霞1，李成磊1，陳 惠1，王安虎2，吳 琦1，*

（1.四川農(nóng)業(yè)大學生命科學學院，四川 雅安 625014；2.西昌學院農(nóng)業(yè)科學學院，四川 西昌 615000）

以暗黑萌發(fā)6 d的苦蕎芽為材料，分別采用LED紅光（630 nm）、LED白光（540 nm）、LED藍光（460 nm）、LED紫外光（385 nm）和普通熒光（混合波長），以光周期為16 h/8 h（晝/夜）27 ℃處理芽期苦蕎3 d。采用半定量反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈式反應（semi-quantitative reverse transcription and polymerase chain reaction ，RT-PCR）分析苦蕎子葉和胚軸中FtPAL、Ft4CL、FtCHS、FtFLS、FtF3H和FtANS 6 個黃酮合成途徑酶基因的表達量，采用AlCl3法測定不同光源處理前后的總黃酮含量，并進行相關(guān)性分析。結(jié)果表明：光源影響總黃酮在子葉中的含量大小順序為：黑暗＜熒光＜白光＜紅光＜藍光＜紫外光，光源影響總黃酮在胚軸中的含量大小順序為：黑暗＜熒光＜紅光＜白光＜藍光＜紫外光；子葉中總黃酮含量與FtPAL、FtCHS、FtF3H和FtANS的表達顯著相關(guān)（相關(guān)系數(shù)＞0.75），其中與FtPAL相關(guān)性最高（相關(guān)系數(shù)為0.921）；胚軸中總黃酮含量僅與Ft4CL表達顯著相關(guān)（相關(guān)系數(shù)為0.975）。因此，光質(zhì)能夠調(diào)節(jié)芽期苦蕎黃酮的積累，可選用UV-B、LED藍光和紅光這3 種組合光通過優(yōu)化光控條件增加黃酮含量。

LED光源；苦蕎；芽期；黃酮；基因表達

苦蕎（Fagopyrum tataricum）屬蓼科蕎麥屬雙子葉，是一年生草本植物，在我國主要分布在西南山區(qū)、云貴高原等地。作為一種藥食兩用的草本植物，與其他谷類作物相比，苦蕎有著更為均衡的營養(yǎng)成分，且富含以蘆丁為代表的黃酮類物質(zhì)，具有降血脂、降血糖和抗氧化等多種保健作用［1-2］。作為一種新型蔬菜，苦蕎芽菜黃酮含量較之籽粒高出數(shù)倍，蘆丁更易吸收，胰蛋白酶活性消失，游離氨基酸、礦物質(zhì)和粗纖維含量均衡，且易于咀嚼，風味獨特［3-6］，深受素食主義者的追捧。

LED（light-emitting diodes），即發(fā)光二極管，是一種可以有效地把電能轉(zhuǎn)變成電磁輻射的裝置［7］。隨著光電技術(shù)的發(fā)展和成本的降低，LED光源逐漸成為作物栽培的首要光源。有報道認為藍光直接或間接影響植物胚軸的伸長、酶的調(diào)節(jié)和合成、氣孔的張開、葉綠體的成熟和光形態(tài)建成［8-9］。21世紀將是生態(tài)農(nóng)業(yè)的世紀，光學在其中起著至關(guān)重要的作用。

目前，已有研究表明可以通過調(diào)節(jié)不同光質(zhì)的光來影響植物芽菜的品質(zhì)，改變其代謝產(chǎn)物累積量［10］。因此，采用不同單色LED光質(zhì)提高苦蕎黃酮累積有望成為有效的方法。本實驗以富含黃酮類化合物的苦蕎作為材料，采用不同單色LED光質(zhì)處理芽期苦蕎，進而分析其黃酮合成相關(guān)基因表達量與黃酮累積的關(guān)系，為提高苦蕎芽菜品質(zhì)的培育提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

供試苦蕎品種“西蕎2號”購于西昌學院。

RNA提取試劑植物RNAout試劑盒 天澤基因公司；RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit 美國Fermentas公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2儀器與設(shè)備

LED單色光源購自廣西南寧見隆科技園，LED燈管每盞由144 顆超亮燈珠組成，功率為10 W，紅光（R 630 nm）、藍光（B 460 nm）、紫外光（UV-B 385 nm），白光（W 540 nm）源，普通日光燈管，色溫均近似為6 500 K。

1.3方法

1.3.1苦蕎種子的催芽及光質(zhì)的選擇

苦蕎種子的萌發(fā)參照Kim等［11］的方法，略有改動：將苦蕎種子置于35 ℃自來水中浸種16 h，催芽后在黑暗溫室內(nèi)用長37 cm，寬28 cm共12 個穴盤進行育苗，育苗基質(zhì)取自四川農(nóng)業(yè)大學生命科學學院苦蕎栽培基地，溫度控制為27 ℃，每隔4～5 h噴灑一次自來水。取黑暗萌發(fā)第6天的苦蕎芽菜為材料，分為5 組，每組兩盤，分別置于LED紅光（630 nm）、LED白光（540 nm）、LED藍光（460 nm）、LED紫外光（385 nm）和普通熒光（混合波長）6 種LED光源下進行光照處理，實驗處理光周期為16 h/8 h（晝/夜）。5 個處理組分別采用相應的燈管2 盞，置于植物頂端（25±3）cm，光強為（50±5） μmol/（m2·s）。

1.3.2苦蕎子葉和胚軸cDNA第一鏈的制備

按照天澤基因公司“植物RNAout試劑盒”說明書，分別提取各個處理組苦蕎子葉和胚軸總RNA。利用RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒以O(shè)ligo-dT18和Random Hexamer Primer為引物，進行cDNA的反轉(zhuǎn)錄，將合成的cDNA第一鏈保存于-20 ℃冰箱中備用。

1.3.3苦蕎子葉和胚軸黃酮合成關(guān)鍵酶基因的半定量反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈式反應（semi-quantitative reverse transcription and polymerase chain reaction，RT-PCR）

以不同光質(zhì)處理3 d后的苦蕎幼苗為材料，以持家基因組蛋白編碼基因FtH3為內(nèi)參，利用RT-PCR技術(shù)檢測FtPAL（苯丙氨酸解氨酶）、Ft4CL（4-香豆酞-CoA連接酶）、FtCHS（查爾酮合酶）、FtFLS（黃酮醇合酶）、FtF3H（黃烷酮-3-羥化酶）和FtANS（花青素合成酶）等6 個黃酮合成關(guān)鍵酶基因在不同光質(zhì)下表達量，引物序列見表1。通過Quantity One（version 4.6.2）軟件分析擴增產(chǎn)物，并進行高斯建模（Gauss-Model）計算光密度值，各基因表達量用相對光密度值ROD（optical density of gene/optical density of H3）表示。

表1　RT-PCR的引物序列Table1 Primer sequenceess

1.3.4苦蕎子葉和胚軸總黃酮的提取與測定

采用李成磊［12］和Liu Benguo［13］等的方法并略作改動。使用AlCl3法建立蘆丁標準曲線，利用紫外-可見分光光度法在420 nm波長處測定苦蕎子葉和胚軸總黃酮的吸光度，根據(jù)AlCl3法建立標準曲線，回歸方程為y=15.738x，相關(guān)系數(shù)R2=0.999，通過標準曲線計算總黃酮含量。

1.4數(shù)據(jù)分析

采用IBM SPSS Statistics 20統(tǒng)計軟件對黃酮合成相關(guān)基因表達量與總黃酮量進行相關(guān)性分析。

2　結(jié)果與分析

2.1不同光質(zhì)對苦蕎幼苗生長的影響

苦蕎幼苗在不同光質(zhì)條件下處理3 d后均能正常生長。黑暗條件下，苦蕎子葉未完全張開，胚軸呈蒼白色；LED紅光條件下，出現(xiàn)3 片苦蕎子葉并且呈現(xiàn)深綠色，胚軸為晶瑩的白色；LED紫外光條件下，出現(xiàn)2 片淺綠色子葉，胚軸整體為深粉紅色；LED白光照射下，出現(xiàn)3 片淺綠色子葉，胚軸中下部位呈現(xiàn)淺粉紅色；普通熒光燈處理下，只出現(xiàn)2 片子葉并且子葉較小未完全張開，胚軸整體呈現(xiàn)白色；在LED藍光照射條件下，苦蕎幼苗整體高度小于紅光及白光組，子葉完全張開，出現(xiàn)3 片，為深綠色，胚軸整體呈現(xiàn)淺粉紅色?？梢?，LED藍光和紫外光能夠有效影響苦蕎芽菜的生長及感觀品質(zhì)。

2.2苦蕎黃酮合成相關(guān)基因的表達量分析

圖1　不同光質(zhì)條件下芽期苦蕎FFttPPAALL（AA）、FFtt44CCLL（BB）、FFttCCHHSS（CC）、FFttFFLLSS（DD）、FFttFF33HH（EE）、FFttAANNSS（F）基因相對表達量Fig.1 FtPAL （A）， Ft4CL （B）， FtCHS （C）， FtFLS （D）， FtF3H （E） and FtANS （F）expression in tatary buckwheat sprouts under different LED lights

由圖1可知，與黑暗組相比，紅光處理的子葉中Ft4CL表達量極顯著上升為61.6%（P＜0.01），胚軸中FtFLS表達量極顯著上升為7.0%（P＜0.01），而FtPAL極顯著下降為4.0%（P＜0.01）；白光處理后子葉中Ft4CL表達量上升最顯著，為185.0%（P＜0.05），胚軸中FtPAL下降最為顯著，為9.3%（P＜0.05）；紫外光處理下子葉中Ft4CL表達量上升最顯著，為220.3%（P＜0.01），胚軸中FtCHS上升最為顯著，為100.2%（P＜0.05）；熒光處理胚軸中FtPAL下降最為顯著，為6.7%（P＜0.05）；LED藍光處理后子葉中Ft4CL表達量上升最為顯著，為220.8%（P＜0.01）。結(jié)果表明，芽期苦蕎不同組織對不同波長光源的敏感性不同，各基因在子葉和胚軸中表達量具有差異性與組織特異性。

2.3苦蕎芽子葉和胚軸中總黃酮含量

圖2　不同光質(zhì)下苦蕎子葉和胚軸中總黃酮含量Fig.2 Total flavonoid contents of cotyledons and hypocotyls under different LED lights

由圖 2可知，芽期苦蕎中子葉的總黃酮含量均高于胚軸。黑暗對照組子葉中總黃酮含量為6.143%，胚軸中含量為0.993%。經(jīng)不同光質(zhì)處理3 d后，LED紅光處理組，芽期苦胚軸中總黃酮含量顯著提高（P＜0.05），為黑暗對照組的1.82 倍；紫外光處理組，芽期苦蕎子葉和胚軸中總黃酮含量，分別為黑暗對照組的2.08 倍（P＜0.01）和5.86 倍（P＜0.01）；LED白光處理組，芽期苦蕎胚軸中總黃酮含量極顯著提高，為對照組的2.12 倍（P＜0.01）；LED藍光處理，芽期苦蕎子葉和胚軸中總黃酮含量均極顯著提高（P＜0.01），為黑暗對照組的1.42 倍和2.73 倍。上述結(jié)果表明，光質(zhì)能夠調(diào)節(jié)苦蕎芽菜黃酮的積累。

2.4苦蕎黃酮合成相關(guān)基因與黃酮積累的相關(guān)性

表2　苦蕎子葉和胚軸中總黃酮與黃酮合成相關(guān)基因表達量的相關(guān)性Table2 Correlation coefficients between gene expression levels involved in flavonoid biosynthesis and total flavanoid contents in cotyledons and hypocotyl of tartary buckwheat

使用IBM SPSS Statistics 20統(tǒng)計軟件分析不同光質(zhì)處理3 d后芽期苦蕎子葉和胚軸中FtPAL、Ft4CL、FtCHS、FtFLS、FtF3H和FtANS基因的相對表達量與總黃酮含量的相關(guān)性，結(jié)果見表2。以相關(guān)系數(shù)絕對值大于0.75為閾值時［14］，在苦蕎子葉中，總黃酮含量變化與FtPAL表達量（相關(guān)系數(shù)為0.921）、FtCHS表達量（相關(guān)系數(shù)為0.856）、FtF3H（相關(guān)系數(shù)為0.858）和FtANS表達量（相關(guān)系數(shù)為0.814）呈正相關(guān)?？嗍w胚軸中，總黃酮含量與Ft4CL表達量（相關(guān)系數(shù)為0.975）呈正相關(guān)。結(jié)果表明，苦蕎黃酮合成相關(guān)酶基因表達量與總黃酮具有一定的相關(guān)性。但子葉和胚軸中存在相關(guān)性的基因并不相同。因此，該過程中苦蕎黃酮在子葉和胚軸中的生物合成可能存在著不同的調(diào)控機制［15-17］。

3　討 論

本研究通過對萌發(fā)6 d后的苦蕎采用5 種不同的光質(zhì)處理3 d，發(fā)現(xiàn)苦蕎幼苗在不同光質(zhì)條件下均能正常生長，但是外觀形態(tài)卻表現(xiàn)出了較大差異?？嗍w芽黃酮含量在紫外光照射條件下最高，推測紫外光照射后，黃酮含量增加使得苦蕎能夠有效減少紫外輻射在植物表皮層的穿透率，減輕紫外對植物器官與組織的傷害。其次為LED藍光、紅光和白光，這與陳大清［18］和魯燕舞［19］等的研究結(jié)果相似。在芽期苦蕎胚軸中，總黃酮含量與Ft4CL表達量雖然呈正相關(guān)，但與FtFLS基因表達量相關(guān)性小，提示苦蕎中存在同源FLS基因，在本實驗條件下該基因可能不是胚軸中合成黃酮的主效基因。由于子葉和胚軸中存在相關(guān)性的基因有區(qū)別，表明在這兩個器官可能存在著不同的調(diào)控黃酮合成的機制。

國內(nèi)外近年來的研究結(jié)果表明，將苦蕎萌發(fā)為芽菜能有效提高苦蕎中各種營養(yǎng)成分，尤其是黃酮的含量，增加苦蕎產(chǎn)品的市場競爭力并創(chuàng)造大量的經(jīng)濟效益。Kim等［3］研究發(fā)現(xiàn)，苦蕎籽粒萌發(fā)6～10 d后，幼苗中總黃酮含量遠高于籽粒。Tsurunaga等［10］研究發(fā)現(xiàn)不同光質(zhì)對苦蕎芽菜的生長與黃酮類化合物如花青素和蘆丁的合成具有很大的影響。本研究表明，通過采用紫外光、LED藍光和LED紅光照射的苦蕎芽菜具有更鮮艷的外觀和更高的黃酮含量，今后可通過進一步優(yōu)化這3 種混合光來培育高品質(zhì)的苦蕎芽菜。

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Effects of LED Lights on the Levels of Flavonoid during Germination of Tartary Buckwheat

LUO Xiaopeng1， BU Xingxing1， ZHAO Haixia1， LI Chenglei1， CHEN Hui1， WANG Anhu2， WU Qi1，*
（1. College of Life Sciences， Sichuan Agricultural University， Ya’an 625014， China；2. School of Agricultural Sciences， Xichang College， Xichang 615000， China）

After tartary buckwheat seeds germinated in darkness for 6 days， their sprouts we re cultivated under lightemitting diode （LED） red light， LED white light， LED blue light， LED UV-B light and fl uorescent light， respectively. They were grown under a 16 h （daytime）：8 h （night） photoperiod at 27 ℃ for 3 days. The transcriptional levels of six genes involved in the fl avonoid biosynthesis pathway， FtPAL， Ft4CL， FtCHS， FtFLS， FtF3H， and FtANS， were investigated by semi-q uantitative RT-PCR. The content of total flavonoids was measured by AlCl3method. The correlation coefficients between total fl avonoids content and the expression levels of fl avonoid biosynthesis-related genes in both cotyledons and hypocotyls were analyzed. Total fl avonoids content in tartary buckwheat cotyledons with different light treatments followed the decreasing order： UV-B ＞ blue ＞ red ＞ white ＞ fl orescence ＞ dark； as for hypocotyls， the decreasing order was UV-B ＞blue ＞ white ＞ red ＞ fl orescence ＞ dark. Total fl avonoids content was signifi cantly correlated with the expression levels of FtPAL， FtCHS， FtF3H and FtANS in cotyledons （correlation coeffi cients ＞ 0.75）. While FtPAL expression showed the highest correlation with total fl avonoids content in cotyledons with correlation coeffi cient of 0.921， only Ft4CL expression level was detected to have a signifi cant correlation with total fl avonoids content in hypocotyls with correlation coeffi cient of 0.975. In conclusion， fl avonoid accumulation during germination of tartary buckwheat could be increased through light regulation， and UV-B， blue and red light could be mixed for induction of more fl avonoids.

LED light； tartary buckwheat； germination； fl avonoids； gene expression

S517

A

1002-6630（2015）03-0086-04

10.7506/spkx1002-6630-201503016

2014-09-10

雒曉鵬（1991—），男，碩士研究生，研究方向為植物分子生物學。E-mail：luoxiaopenglxp@163.com

吳琦（1973—），男，教授，博士，研究方向為植物分子生物學。E-mail：wuqiwq@163.com