復(fù)元膠囊對大鼠膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎軟骨組織TGF-β1的影響

鄧紫婷，周國慶，李榮亨

（1.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬康復(fù)醫(yī)院，重慶 400050；2.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合科，重慶 400016）

骨關(guān)節(jié)炎（Osteoarthritis，OA）是以關(guān)節(jié)軟骨破壞為特點的退行性關(guān)節(jié)疾病，是在機械性和生物性因素作用下，破壞了關(guān)節(jié)軟骨細胞、細胞外基質(zhì)和軟骨下骨的正常合成與降解耦聯(lián)的結(jié)果，多發(fā)生在中老年人，是致殘的高發(fā)性疾病［1］。關(guān)節(jié)軟骨的生長及基質(zhì)的合成與生長因子密切相關(guān)，轉(zhuǎn)化生長因子β1（TGF-β1）是其中之一。TGF-β1是一種多功能細胞因子，廣泛參與哺乳動物的各組病理生理過程，研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β1具有促進骨和軟骨細胞增殖、分化和細胞外基質(zhì)合成的作用。體外研究發(fā)現(xiàn)TGF-β1可促進II型膠原的合成，誘導(dǎo)間充質(zhì)細胞向軟骨細胞分化并形成軟骨組織。

復(fù)元膠囊是治療骨關(guān)節(jié)炎的中藥復(fù)方制劑，治療OA療效確切，不良反應(yīng)少。前期研究顯示，復(fù)元膠囊通過調(diào)節(jié)細胞因子、基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPS）及其抑制劑（TIMPS）和生長因子之間的平衡［2-4］，減少Ⅱ型膠原和蛋白多糖的降解［5］，促進細胞增殖，減少細胞凋亡，從而起到防治OA作用［6-7］。本研究通過建立大鼠膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎模型，觀察不同濃度的復(fù)元膠囊對關(guān)節(jié)軟骨中TGF-β1表達的影響，探討復(fù)元膠囊能否通過上調(diào)TGF-β1表達，促進細胞外基質(zhì)的合成，從而達到防治OA的作用。

1 材 料

動物。雄性8周齡SD大鼠60只，體質(zhì)量（200±10）g，由重慶醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心提供，實驗動物生產(chǎn)許可證號SYSK2002007。

藥品。復(fù)元膠囊為重慶希爾安藥業(yè)公司生產(chǎn)（渝衛(wèi)2002［42-33］），由黃芪、人參、川芎、丹參、淫羊藿、鹿角膠、肉蓯蓉、骨碎補、枸杞子等組成，每粒0.41g，每1g含生藥3g；抗骨增生膠囊為江蘇康緣股份有限公司生產(chǎn)（生產(chǎn)批號110402）。

主要試劑。TGF-β1多克隆抗體購于北京鼎國昌盛技術(shù)有限公司，SABC試劑盒及DAB顯色劑購于武漢博士德生物工程有限公司，軟骨總提取試劑盒、cDNA第一鏈合成試劑盒及2X Es Taq MasterMix（含染料）均來自于北京康為世紀，TGF-β1及內(nèi)參GAPDH引物由TakaRa公司合成。

儀器。BX50型光學(xué)顯微鏡來自日本OLYMPUS公司，DNA engine PT-200 PCR儀和BIO-RAD凝膠成像儀來自美國BIORAD公司。

2 方 法

分組及造模。60只大鼠隨機分為正常組，模型組，抗骨增生膠囊組，復(fù)元膠囊低、中、高劑量組各10只。Hulth法［8］建立OA模型，用10%水合氯醛按照0.3mL/100g腹腔注射麻醉大鼠，在無菌條件下切斷大鼠右膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)副韌帶，完整切除內(nèi)側(cè)半月板及剪斷前后交叉韌帶逐層縫合，無菌包扎。術(shù)后給予肌注青霉素抗感染，共7天。術(shù)后1周開始每天驅(qū)趕大鼠跑步30min，共驅(qū)趕8周。正常組大鼠不給予任何處理。

給藥。依據(jù)Meeh-Rubner公式計算大鼠的等效給藥劑量，復(fù)元膠囊低、中、高劑量組分別給予復(fù)元膠囊371.65、743.30、2229.90mg/（kg·d），抗骨增生膠囊組給予抗骨增生膠囊557.00mg/（kg·d），均配置成3mL溶液，正常組和模型組給予生理鹽水灌胃，于術(shù)后第2周開始，每天灌胃1次，共8周。

大體觀察及光鏡觀察關(guān)節(jié)軟骨細胞及細胞外基質(zhì)。于治療后第8周處死各組大鼠共60只，觀察并記錄關(guān)節(jié)囊、滑膜、關(guān)節(jié)軟骨及關(guān)節(jié)液的一般情況，并于光學(xué)顯微鏡下觀察膝關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)軟骨的情況，按Pelletier-JP標準進行評分。取脛骨平臺全層軟骨連同軟骨下骨標本，將其中一部分放置在-80℃冰箱保存，一部分在4%多聚甲醛溶液中固定24h，10%EDTA脫鈣15天，常規(guī)石蠟包埋，切片H E染色觀察軟骨組織結(jié)構(gòu)、細胞數(shù)量和潮線的完整性。依據(jù)Mankin’s法［9］評分標準進行評分，0級為正常，1級為表層破壞，2級為血管翳及表層破壞，3級為淺層裂隙形成，4級為局限性深達骨質(zhì)的裂隙，5級為大面積深達骨質(zhì)的軟骨缺如，6級為負重區(qū)軟骨全部丟失。

免疫組化法檢測關(guān)節(jié)軟骨中TGF-β1的蛋白表達。切片脫蠟至水，3%H2O2室溫15min滅活內(nèi)源性過氧化物酶。沖洗后PBS浸泡5min，胰蛋白酶消化液修復(fù)抗原活性20min，正常山羊血清封閉，滴加1∶50的稀釋兔抗大鼠TGF-β1多克隆抗體，4℃孵育過夜。PBS沖洗5min，3次。滴加生物素標記的二抗（武漢博士德），37℃孵育30min，PBS沖洗5min，3次。滴加SABC-HRP（武漢博士德），37℃孵育30min。PBS沖洗5min，3次。二甲苯聯(lián)苯胺（DAB）室溫下顯色至滿意，自來水終止反應(yīng)。蘇木素復(fù)染3min，洗去多余染液，鹽酸酒精分化2s，碳酸鋰復(fù)染1min，酒精梯度脫水后封片，顯微鏡下觀察。圖像分析：每個標本取5張切片，每張切片OLYMPUS BX50顯微鏡下放大200倍，隨機取5個視野，采用Image-Pro Plus圖像分析軟件測定陽性染色平均累積光密度（IOD）。

關(guān)節(jié)軟骨總RNA提取和半定量RT-PCR檢測TGF-β1的mRNA表達。取損傷區(qū)軟骨30mg在液氮中研磨成粉末，然后用TRIzon提取總RNA，紫外分光光度計檢測樣品吸光度（A），A260/A280為1.8～2.0。每組取1μL總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA（dNTP Mix，2.5mM Each 4u、Primer Mix 2μL、RNA Template 2μL、5×RT Buffer 4μL、DTT，0.1M、HiFi-MmLV，200U/μL，1μL、RNasefree Water 5μL）。取cDNA1ul進行PCR擴增。其中TGF-β1引物序列為F（5'ATGGTGGACCGCAACAAC3'），R（5'GAGCACTGAAGCGAAAGC3'）；反應(yīng)條件為變性94℃30s，退火58.6℃30s，延伸72℃30s，共30個循環(huán)，72℃延伸5min。GAPDH引物序列為F（5' GTGCTGAGTATGTCGTGGAGTCT3'）；R（5'GTGGAAGAATGGGAGTTGCTGT3'）；反應(yīng)條件為變性94℃30s，退火58.5℃30s，延伸72℃45s，共30個循環(huán)，72℃延伸5min。擴增完畢后取5ul產(chǎn)物于含50ul/LGoldViewTM核酸染料的1.5%瓊脂糖凝膠中電泳，用BRORAD凝膠圖像分析軟件檢測各組目的基因及內(nèi)參的光密度值。

用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，計量資料以（±s）表示、用t檢驗。

3 結(jié) 果

各組大鼠一般情況。造膜過程中動物無死亡，術(shù)后無感染，健康狀況良好，術(shù)后模型組及治療組，局部刺激有疼痛反應(yīng)，患肢收縮痙攣，后肢跛行明顯，蹬地力量減弱，伴有關(guān)節(jié)不穩(wěn)，有異?；顒佣?，1周后消失，8周后關(guān)節(jié)畸形腫大，正常組關(guān)節(jié)外部結(jié)構(gòu)正常，無腫脹，活動自如。

大體形態(tài)觀察見表1。正常組關(guān)節(jié)面平整光滑，呈淡藍色，色澤明亮，無裂紋及軟化，滑膜無增生，關(guān)節(jié)液清涼透明，模型組病理改變明顯，軟骨面糜爛，顏色灰暗，失去光澤，軟骨邊緣增生明顯，多數(shù)標本可見大小不等的潰瘍，并深達骨質(zhì)，軟骨下骨暴露，滑膜不同程度增生粘連，關(guān)節(jié)液增多、混濁。復(fù)原膠囊高、中劑量組及抗骨增生組軟骨面稍粗糙，顏色淡黃，軟骨邊緣有增生，部分有裂紋及小潰瘍出現(xiàn)，滑膜可見少許增生，關(guān)節(jié)液略增多。

評分標準：0分為關(guān)節(jié)面透明光整，色澤正常；1分為關(guān)節(jié)面粗糙，有裂隙，色澤灰暗；2分為關(guān)節(jié)面糜爛，軟骨缺損深達軟骨表層和中層；3分為關(guān)節(jié)面潰瘍形成，缺損深達軟骨深層；4分為軟骨剝脫，軟骨下骨暴露。各組膝關(guān)節(jié)軟骨退化評分見表1。

表1 各組膝關(guān)節(jié)軟骨退變程度評分比較 （只）

HE染色后觀察軟骨組織見表2。正常組軟骨組織軟骨表層光滑平整，細胞排列整齊，基質(zhì)染色均勻，潮線清晰；模型組軟骨組織層變薄，表層有裂隙，細胞數(shù)目變少，排列紊亂，潮線嚴重斷裂模糊；抗骨增生膠囊組軟骨表面欠光整，細胞層數(shù)明顯增多，排列稍紊亂，潮線少許斷裂；復(fù)元膠囊低劑量組表層裂隙形成，細胞數(shù)目減少，排列紊亂，隱窩出現(xiàn)空泡樣改變，潮線紊亂；復(fù)元中劑量組染色均勻，細胞層增生，細胞數(shù)目增多；復(fù)元高劑量組表層尚且光滑平整，細胞有明顯增生，中深層有少量細胞簇聚，可見雙重潮線。

免疫組化法檢測軟骨組織中TGF-β1表達見表2。正常組軟骨在表層見少許陽性細胞；模型組及其余各組軟骨組織見不同程度著色，軟骨細胞的胞漿及胞核中可見黃色顆粒著色；復(fù)元膠囊中劑量組和高劑量組與模型組比較，TGF-β1的表達有明顯增加，尤其以復(fù)元膠囊高劑量組最為顯著。

表2 8周各組大鼠關(guān)節(jié)軟骨Mankin評分及軟骨組織中TGF-β1的表達 （IOD，±s）

表2 8周各組大鼠關(guān)節(jié)軟骨Mankin評分及軟骨組織中TGF-β1的表達 （IOD，±s）

注：與正常組比較，*P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05；與抗骨增生組比較，□P＜0.05。

組別 只 Mankin評分 TGF-β1正常組 10 0.34±0.06 0.63±0.017模型組 10 7.3±0.45* 0.34±0.017*抗骨增生膠囊組 10 3.9±0.73△ 0.68±0.038#復(fù)元膠囊低劑量組 10 5.4±0.48△ 0.42±0.031#復(fù)元膠囊中劑量組 10 3.8±0.6△ 0.94±0.018△復(fù)元膠囊高劑量組 10 2.1±0.53△□ 1.31±0.043△□

RT-PCR法測定軟骨組織中TGF-β1的mRNA表達見圖2。各組軟骨組織提取的RNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄和擴增后，電泳顯示強弱不等的熒光。經(jīng)圖像軟件分析結(jié)果顯示，模型組TGF-β1表達顯著降低，與其余各組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；與抗骨增生膠囊組比，復(fù)元膠囊高劑量組TGF-β1的mRNA的表達量增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），而復(fù)元膠囊低劑量組和中劑量組表達無明顯改變，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

4 討 論

骨關(guān)節(jié)炎以其高發(fā)病率及高致殘率而受到醫(yī)學(xué)界的廣泛關(guān)注，且其療效不顯著也成為了國內(nèi)外研究的熱點。骨關(guān)節(jié)炎的主要臨床表現(xiàn)為關(guān)節(jié)疼痛、關(guān)節(jié)畸形及功能障礙，目前治療OA，主要包括基礎(chǔ)治療、藥物治療、傳統(tǒng)治療、物理治療、關(guān)節(jié)腔注藥和沖洗、外科手術(shù)，以及軟骨移植、基因治療、生物治療、軟骨膜和骨膜移植等新療法。外科手術(shù)治療痛苦大且費用高昂，新療法尚處起步階段，有待于進一步研究。為提高廣大骨關(guān)節(jié)炎患者的生活質(zhì)量，尋找一種經(jīng)濟、安全、易行的治療方法是非常重要的［10-11］。

骨關(guān)節(jié)炎屬中醫(yī)“骨痹”范疇。病因病機為氣血不足，肝腎虧虛，風(fēng)寒濕侵入骨髓，痹阻經(jīng)絡(luò)導(dǎo)致筋骨失養(yǎng)。證屬肝腎虧虛，氣滯血瘀。治以補腎壯骨，益氣活血為主。復(fù)元膠囊中人參、黃芪益氣活血，具有抗疲勞、抗缺氧、增強機體適應(yīng)能力的作用。川芎、丹參行氣活血，其有效成分川芎嗪和阿魏酸有改善微循環(huán)的作用，且有研究表明川芎嗪能有效防治骨關(guān)節(jié)炎。鹿茸、淫羊藿補腎壯陽、強筋健骨，有調(diào)節(jié)免疫和促性腺激素樣作用，且性激素有促進軟骨細胞增殖的作用［12］。

實驗結(jié)果顯示，TGF-β1在正常組有適量表達，而在模型組TGF-β1表達降低；與模型組比較，復(fù)元膠囊各組和抗骨增生膠囊組TGF-β1的表達有明顯增加，以復(fù)元高劑量組增加最為顯著，提示復(fù)元膠囊高劑量組療效優(yōu)于抗骨增生膠囊組。

通過測定軟骨組織中TGF-β1的表達水平證實，復(fù)元膠囊能夠通過上調(diào)TGF-β1的表達，促進軟骨細胞和細胞外基質(zhì)的增生，從而減輕關(guān)節(jié)軟骨的損傷，延緩OA的發(fā)展進程。

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