大豆雄性不育系和恢復(fù)系花器特性及花蕾生化特性研究

于德彬， 李志剛， 劉 鵬， 向殿軍

(內(nèi)蒙古民族大學(xué)農(nóng)學(xué)院，內(nèi)蒙古通遼 028042)

大豆(GlycinemaxL.)富含蛋白質(zhì)和異黃酮，是一種糧油兼用作物，亦可用于飼料、工業(yè)原料和藥用[1]。隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和人們生活水平的提高，居民對植物油脂和肉制品的需求逐年增多，導(dǎo)致我國大豆需求量逐年增加。2016年我國進(jìn)口轉(zhuǎn)基因大豆8 391萬t，較2015年增加222萬t，對外依賴度已經(jīng)高達(dá)87%[2]。相反，我國大豆種植面積卻在減少，主要?dú)w因于國產(chǎn)大豆產(chǎn)量低，種植效益遠(yuǎn)不如水稻、玉米等作物，以及國外轉(zhuǎn)基因大豆進(jìn)口沖擊。提高國產(chǎn)大豆產(chǎn)量是解決這一嚴(yán)峻問題的重要途徑之一。

雜種優(yōu)勢是生物界普遍存在的一種現(xiàn)象，已經(jīng)在高粱、玉米、水稻等多種糧食作物和蔬菜中得到廣泛的應(yīng)用，是提高作物產(chǎn)量和加速植物遺傳改良進(jìn)程的重要途徑之一。大量研究結(jié)果表明，利用大豆雜交種可提高大豆產(chǎn)量[3-4]。雜交豆1號是世界上第1個通過審定的大豆雜交種，由吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院趙麗梅等利用“三系”法選育，2年區(qū)試平均較對照增產(chǎn)21.9%[5]。吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院于2006年又選育審定了2年區(qū)試平均較對照增產(chǎn)22.7%的雜交豆2號新品種[6]，之后他們的雜交豆3號、雜交豆5號、吉育607、吉育609等多個大豆雜交種相繼通過審定[7-10]。雜優(yōu)豆1號是世界上第1個通過審定的夏大豆雜交種，由安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院選育，2年區(qū)試平均較對照增產(chǎn)15.37%[11]，之后他們又選育審定了2年區(qū)試平均較對照增產(chǎn)5.81%的雜優(yōu)豆2號高蛋白雜交大豆品種[12]。

然而，大豆雜交種目前還沒有得到大規(guī)模運(yùn)用，其主要原因是受制于大豆制種技術(shù)，制種的產(chǎn)量低是限制大豆雜交種推廣的主要因素。因此選育優(yōu)良的不育系(龍骨瓣開張時間長及程度大、柱頭壽命長、蜜腺引誘昆蟲造訪的特性等)、保持系和恢復(fù)系(花粉數(shù)量多、散粉性好、龍骨瓣開張時間長及程度大、花粉壽命長、蜜腺引誘昆蟲造訪的特性等)，選配高產(chǎn)的雜交組合，是推動大豆雜交種商業(yè)化生產(chǎn)的主要途徑。本研究對3個大豆恢復(fù)系及8個大豆不育系的花器官形態(tài)特征進(jìn)行了研究，同時對不育系和恢復(fù)系的小孢子發(fā)育過程及花蕾中保護(hù)酶活性進(jìn)行了測定分析，旨在揭示大豆雄性不育系小孢子敗育的細(xì)胞學(xué)機(jī)制和生化特性，為大豆雄性不育系的選育及利用、推動大豆雜交種的商業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料為8個大豆雄性不育系和3個大豆恢復(fù)系，由吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院大豆研究中心提供。8個大豆雄性不育系命名為M1、M2、M3、N4、M5、M6、M7、M8；3個大豆恢復(fù)系命名為N1、N2、N3。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計

大豆雄性不育系和恢復(fù)系材料于2016年春種植于內(nèi)蒙古民族大學(xué)北區(qū)試驗(yàn)教學(xué)基地。試驗(yàn)地位于內(nèi)蒙古通遼地區(qū)，年平均降水量361.6 mm，無霜凍期150 d，≥10 ℃活動積溫3 200 ℃。試驗(yàn)土壤類型以黃沙土和栗沙土為主，0～20 cm 土層土壤空隙度為34%～38%、有機(jī)質(zhì)含量為 5.31 g/kg、堿解氮含量為42.4 mg/kg，前茬為玉米，肥力中等。試驗(yàn)采用裂區(qū)設(shè)計，3個恢復(fù)系為主區(qū)，8個不育系為副區(qū)，共有3個區(qū)組，重復(fù)3次，種植在網(wǎng)室且相互隔離良好的9個小區(qū)，每個小區(qū)單獨(dú)分離成8個地塊，每個地塊面積 5 m2，長5 m，寬1 m，行距0.5 m，株距0.15 m，每個小區(qū)都有網(wǎng)室隔離，防止花期昆蟲串粉，試驗(yàn)面積共計450 m2，采用穴播的方式，每穴保證出苗2株，灌排水條件良好，5月21日出苗，待開花期進(jìn)行人工放蜂處理。

1.3 調(diào)查與測定項(xiàng)目

花長、旗瓣寬、花瓣大小和龍骨瓣開張度(ODKP)調(diào)查在盛花期上午進(jìn)行。從6月21日開始，每5 d從選定掛好標(biāo)簽的10株大豆上取1次樣，采樣的位置是植株生長點(diǎn)，每次采集20～30個大豆花芽，放入裝有FAA固定液的離心管中，固定24 h以上，按陳利娜等的方法[13]制作石蠟切片，用于觀察雄性不育系和恢復(fù)系的花原基、花萼原基、花瓣原基及雌雄蕊原基、雌雄蕊和花粉粒的發(fā)育結(jié)構(gòu)。采集小花蕾、中花蕾和大花蕾時期的花芽樣本，用于檢測8個不育系與3個恢復(fù)系中過氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化氫酶(CAT)的活性以及丙二醛(MDA)含量。各指標(biāo)進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)?？寡趸?POD、SOD、CAT)活性分別采用愈創(chuàng)木酚法[14]、氮蘭四唑(NBT)光還原法[15]和紫外分光光度法[16]進(jìn)行測定。MDA含量參照Hu等的方法[17]進(jìn)行測定。

1.4 數(shù)據(jù)分析

利用SPSS 16.0軟件統(tǒng)計各處理3次重復(fù)數(shù)據(jù)的平均值、各測定3次重復(fù)數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)差以及各指標(biāo)數(shù)據(jù)間的差異顯著性，利用Excel軟件繪制柱形圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 大豆雄性不育系和恢復(fù)系的花芽分化

利用石蠟切片法，對不同發(fā)育階段的大豆花芽進(jìn)行解剖結(jié)構(gòu)觀察，綜合花芽原基形態(tài)變化和花芽分化的特點(diǎn)，可將大豆的花芽分化過程分為5個時期，即花原基形成期、花萼原基形成期、花瓣原基及雌雄蕊原基形成期、雌雄蕊結(jié)構(gòu)形成期和花粉粒形成期(圖1)。在花芽分化的第1個時期，恢復(fù)系N1的花原基發(fā)育正常，但不育系M2的發(fā)育不完整，輸導(dǎo)組織的發(fā)育進(jìn)程比恢復(fù)系發(fā)展緩慢(圖1-A)。在花萼原基形成期，恢復(fù)系的萼片結(jié)構(gòu)發(fā)育完整，細(xì)胞排列的緊密，而不育系的萼片原基形成的細(xì)胞排列疏松(圖1-B)。花瓣原基和雌雄蕊原基的形成期如圖1-C所示，恢復(fù)系N1開始分化出10個花粉囊和1枚雌蕊，發(fā)育走向成熟，不育系M2的花瓣原基和雌雄蕊原基形成期的維管束細(xì)胞不夠明顯。在雌雄蕊結(jié)構(gòu)形成期，恢復(fù)系N1的雄蕊分化成10枚，10個花粉囊里開始形成花藥，雌蕊只有1枚，而不育系M2維管束細(xì)胞排列不緊密，也能夠分化花藥，但花粉粒形狀不規(guī)則，可能是退化的花藥(圖1-D)?；ㄑ糠只淖詈?個時期如圖1-E所示，恢復(fù)系N1能繼續(xù)發(fā)育，10個花粉囊里產(chǎn)生大小一致、飽滿的圓形或橢圓形的花粉粒，且花粉粒數(shù)量比較多，不育系M2產(chǎn)生的花粉粒數(shù)量比較少，大小不等，形狀不規(guī)則，有的花粉粒呈三角形，有的呈空癟狀，有的呈聚集成塊的退化花粉。

2.2 大豆雄性不育系和恢復(fù)系花器外部形態(tài)比較

由表1可知，花長和旗瓣寬在恢復(fù)系和不育系及多重處理中均達(dá)到極顯著差異水平，花瓣大小在不育系和恢復(fù)系中均達(dá)到極顯著差異水平，在多重處理上沒有差異。龍骨瓣開張度在不育系中達(dá)到極顯著差異水平，在恢復(fù)系和多重處理上沒有差異。

表1花長、旗瓣寬、花瓣大小、龍骨瓣開張度的方差分析

注：“**”表示差異極顯著(P<0.01)。

由表2可知，主處理的3個恢復(fù)系中，N3的花長、旗瓣寬和花瓣面積最大，分別為8.28 mm、6.75 mm和56.04 mm2，與其他2個恢復(fù)系存在極顯著差異。副處理的8個不育系中，M4的花長、旗瓣寬和花瓣面積最大，分別為9.19 mm、7.12 mm 和65.53 mm2，明顯高于其他不育系；M5的龍骨瓣開張度最小，而M2的龍骨瓣開張度最大，為M7的3.05倍。

表2主處理和副處理的花長、旗瓣寬、花瓣大小及龍骨瓣開張度

注：同列數(shù)據(jù)后不同小寫字母、大寫字母分別表示在0.05、0.01 水平上差異顯著。表3同。

裂區(qū)設(shè)計試驗(yàn)結(jié)果(表3)顯示，N3M4處理的花長最大，達(dá)9.59 mm，是最小處理N2M8的1.48倍。N3M4處理的旗瓣寬最大，達(dá)7.66 mm，明顯高于其他處理。N3M4的花瓣面積最大，達(dá)73.51 mm2，與其他處理均差異極顯著。N2M5、N1M5和N3M5處理的龍骨瓣開張度都為零，而N3M2處理的龍骨瓣開張度最大，為8.38%，比N1M7高210.4%。綜合花長、旗瓣寬、花瓣大小和龍骨瓣開張度的處理效應(yīng)，N3M4處理最好。

2.3 超氧化物歧化酶(SOD)活性變化

大豆不同發(fā)育時期花蕾中SOD活性的測定結(jié)果(圖2)顯示，除不育系M7和M8外，所有不育系大、中、小花蕾的SOD活性均比3個恢復(fù)系高?；謴?fù)系N2和N3花蕾的SOD活性都隨著花蕾的發(fā)育進(jìn)程而逐漸上升，而恢復(fù)系N1中花蕾的SOD活性要比小花蕾和大花蕾高。不育系M2的SOD活性的最高值出現(xiàn)在中花蕾時期，而其余7個不育系SOD活性的最高值均出現(xiàn)在大花蕾時期。

表3裂區(qū)處理間花長、旗瓣寬、花瓣大小和龍骨瓣開張度

2.4 過氧化物酶(POD)活性變化

POD活性的測定結(jié)果(圖3)表明，在小花蕾時期，有6個不育系(M1、M2、M3、M5、M6和M7)的POD活性顯著高于3個恢復(fù)系；而在中花蕾和大花蕾時期，8個不育系的POD活性均明顯高于3個恢復(fù)系。恢復(fù)系N2的POD活性隨著花蕾的發(fā)育逐漸降低，恢復(fù)系N3的POD活性呈先降低后升高的趨勢，而恢復(fù)系N1的POD活性呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢。多數(shù)不育系的POD活性隨著花蕾的發(fā)育而逐漸增加，而不育系M5花蕾中POD活性則不斷減弱；不育系M2和M8的POD活性在小花蕾階段稍低，到中花蕾階段有一定幅度上升，而在大花蕾階段又開始下降。

2.5 過氧化氫酶(CAT)活性變化

圖4結(jié)果顯示，不育系M2、M4、M5、M6和M7的CAT活性隨著花蕾的發(fā)育而呈現(xiàn)遞增趨勢；不育系M8的CAT活性在小花蕾和大花蕾時期較低，而在中花蕾時期較高；不育系M1和M3的CAT活性隨著花蕾的發(fā)育呈現(xiàn)一定的規(guī)律，即在小花蕾階段CAT活性稍高，到中花蕾階段CAT活性稍有降低，而在大花蕾階段CAT活性又開始增加，達(dá)到最高值?；謴?fù)系N1和N2的CAT活性隨著花蕾的發(fā)育表現(xiàn)出先增加后下降的趨勢，而恢復(fù)系N3的CAT活性最高值出現(xiàn)在大花蕾時期。隨著花蕾的發(fā)育，所有不育系的CAT活性都明顯低于3個恢復(fù)系。

2.6 丙二醛(MDA)含量變化

MDA含量的測定結(jié)果(圖5)顯示，在花蕾發(fā)育的各個時期，不育系的MDA含量均顯著高于恢復(fù)系。3個恢復(fù)系的MDA含量均隨花蕾的發(fā)育表現(xiàn)出增長趨勢。8個不育系的MDA含量均在大花蕾時期達(dá)到最高，但其變化規(guī)律有所不同。其中，3個不育系(M1、M2和M8)的MDA含量隨著花蕾的發(fā)育表現(xiàn)出升高趨勢，其余5個不育系的MDA含量隨著花蕾的發(fā)育表現(xiàn)出先降后升的趨勢。

3 討論與結(jié)論

玉米、油菜、高粱、水稻等作物利用風(fēng)媒傳粉、昆蟲傳粉或人工授粉中的一種或幾種均實(shí)現(xiàn)了雜交種的大規(guī)模商業(yè)化生產(chǎn)。作為一種比較嚴(yán)格的自花授粉作物，大豆特殊的花器結(jié)構(gòu)特征決定了大豆的天然異交率一般低于1%，所以無論是不育系的選育及繁殖，還是雜交種的生產(chǎn)，其效率都比較低。大豆花數(shù)量較多，但是花器較小，附著的花粉少而黏重，另外花朵開放時，柱頭和花藥被龍骨瓣和翼瓣緊緊包住而不外露，大面積異花間通過風(fēng)媒傳粉和人工授粉是難以實(shí)現(xiàn)的。目前大豆雜交種的制備主要通過昆蟲(苜蓿切葉蜂、薊馬等)進(jìn)行傳粉[5，18]，所以對雜交種生產(chǎn)的氣候條件較為苛刻。良好的環(huán)境條件能使大豆花開放度較高，散粉性能好，分泌花蜜多，傳粉昆蟲活躍。內(nèi)蒙古通遼地區(qū)年平均降水量361.6 mm，年蒸發(fā)量1 705.6 mm，屬半干旱大陸性季風(fēng)氣候[19]，大豆開花期少雨，且耕地有良好的地下水灌溉條件，所以較適合大豆雜交種的生產(chǎn)。在該環(huán)境下，恢復(fù)系中，N3的花長、旗瓣寬和花瓣面積最大，可達(dá)8.28 mm、6.75 mm和56.04 mm2；不育系中，M4的花長、旗瓣寬和花瓣面積最大，可達(dá)9.19 mm、7.12 mm 和65.53 mm2。

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