中藥石韋中黃酮類化合物的含量及抗氧化活性研究

唐雅楠，曹雪原，邵 尉，高德民

(山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，山東 濟南 250355)

《中國藥典》(2015版)規(guī)定中藥石韋(Pyrrosiae folium)的基源植物為水龍骨科石韋屬植物：石韋、廬山石韋和有柄石韋，其廣布于華中、西北和西南各省區(qū)，地上部分可作藥用，味苦、甘，性微寒，具有利尿通淋、清肺止血的功效[1]。石韋屬藥材的主要有效成分包括綠原酸、杧果苷、異杧果苷、槲皮素、異槲皮素、里白烯、β-谷甾醇、蔗糖等多種成分[2]，其中黃酮類成分十分豐富。黃酮類化合物是廣泛存在于自然界中，且較早被人類發(fā)現(xiàn)的一類天然化合物，常以游離態(tài)或與糖結(jié)合成苷的形式存在[3]，在生物體內(nèi)有預(yù)防心血管疾病、防癌抗癌、調(diào)節(jié)免疫、抗衰老、抗菌抗病毒、抗炎抗過敏、止血陣痛等諸多功效[4]。天然黃酮類化合物的作用及價值已受到了普遍的關(guān)注[5]，目前已在眾多中草藥中提取出了黃酮類化合物，如肉桂[6]、沉香葉、金蓮花[7等，而有關(guān)石韋黃酮類化合物的研究報道較少，因此，本研究通過對中藥石韋中黃酮類化合物的分離純化及抗氧化活性研究，有助于為進一步開發(fā)中藥石韋提供依據(jù)。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

紫外-可見分光光度計(上海菁華科技儀器有限公司)；RE52AA 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(菏澤鑫源儀器儀表有限公司)；KQ-250DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；HH-S水浴鍋(濟南啟科儀器有限公司)。

1.2 試劑

聚酰胺(60 ～ 100目)；石油醚；乙酸乙酯；正丁醇；無水乙醇(天津市富宇精細化工有限公司)；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)；雙氧水(山東利爾康醫(yī)療科技股份有限公司)、FeSO4、水楊酸、抗壞血酸、鄰苯三酚、三(羥甲基)氨基甲烷(Tris-HCl)等均購自科密歐。

1.3 材料

實驗所用藥材均購自漱玉平民大藥房，經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)高德民副教授鑒定為中藥石韋。

2 方法

2.1 黃酮類化合物的提取

中藥石韋粉碎，過2號篩，石油醚充分攪拌后浸泡過夜(料液比1∶20)[8]。抽濾，晾干后粉末加70%乙醇(料液比1∶20)，60℃下超聲提取40 min[9]，抽濾得到提取液，提取液減壓濃縮，備用。

2.2 黃酮類化合物的分離

將上述提取液，加入適量乙酸乙酯反復(fù)多次萃取，待乙酸乙酯層無色后，合并乙酸乙酯萃取液。用水飽和正丁醇溶液繼續(xù)萃取，待正丁醇層無色后停止，合并正丁醇萃取液。將乙酸乙酯萃取液和正丁醇萃取液分別減壓濃縮，干燥后，乙酸乙酯萃取物記為S1，并進行聚酰胺分離，正丁醇萃取物記為S5。

2.3 聚酰胺柱色譜純化

方法參考趙春艷[10]對沙蔥中黃酮類化合物分離純化的研究，分別用30%、50%、75%乙醇對乙酸乙酯萃取物(S1)洗脫，洗脫液經(jīng)減壓濃縮并蒸干后得到3個樣品，分別記為S2、S3、S4，然后進一步干燥成粉末，備用。

2.4 樣品黃酮類化合物含量的測定

2.4.1 標準曲線的制定

蘆丁標準液曲線的制作參考王瑞蘭等[11]人對廬山石韋中黃酮提取工藝的研究，得標準曲線回歸方程Y=13.038X-0.0131，R2=0.9987。

2.4.2 樣品中黃酮類化合物含量的測定

取適量S1、S2、S3、S4和S5溶于少量乙醇，經(jīng)適當(dāng)稀釋后，按照上述方法測定待測液中黃酮含量。按照回歸方程計算樣品中黃酮類化合物含量，平行試驗3次。

2.5 樣品抗氧化活性的測定

2.5.1 DPPH自由基清除能力測定

分別移取2 mL不同濃度的樣品醇溶液于試管中，各加入2 mL 0.08 mmol/L 的DPPH溶液，避光反應(yīng)30 min 后，在517 nm 處測得吸光度Ai。用抗壞血酸作陽性對照。清除率計算公式如下：

清除率%= [1-(Ai-Aj)/A0]×100%

式中：A0為蒸餾水代替樣品時的吸光度，Aj為無水乙醇代替DPPH時的吸光度。

2.5.2 羥基自由基清除能力測定

分別移取2 mL 不同濃度的樣品醇溶液于試管中，加入2.5 mmol/L 的FeSO4溶液、2.5 mmol/L 的水楊酸溶液各1 mL，最后加入1 mL 2.5 mmol/L 的H2O2溶液，靜置30 min，在510 nm 處測得吸光度Ai。用抗壞血酸作陽性對照。清除率計算公式如下：

清除率%=[1-(Ai-Aj)/A0]×100%

式中：A0為蒸餾水代替樣品時的吸光度，Aj為蒸餾水代替H2O2溶液時的吸光度。

3 結(jié)果

3.1 樣品中黃酮類化合物的含量

表1 黃酮類化合物的含量(n=3)Table 1 The content of flavonoids(n=3)

用硝酸鋁比色法測定各樣品中黃酮類化合物含量，結(jié)果表明：S1中黃酮類化合物的含量大于S5中黃酮類化合物的含量；S4中黃酮類化合物的含量最高，為0.5834 mg/mL；S1其次，黃酮類化合物的含量為0.5165 mg/mL；S5再次，黃酮類化合物的含量為0.4622 mg/mL；S2最少，黃酮類化合物的含量為0.2509 mg/mL。

3.2 樣品的抗氧化活性

3.2.1 樣品對DPPH自由基的清除能力

圖1 樣品對DPPH自由基的清除率Fig.1 Scavenging rate of DPPH radical by samples

通過DPPH法測得各樣品抗氧化活性，結(jié)果表明：在0～200μg/mL 范圍內(nèi)，樣品的抗氧化活性隨黃酮類化合物濃度的增高而增高，當(dāng)濃度為200μg/mL 時，Vc的清除率為96.46%，S4的清除率為78.20%，S5清除率為63.8%，S3清除率為61.05%，S2清除率為48.84%，其清除率從大到小的順序為：Vc>S4>S5>S3>S2。通過計算IC50得：Vc的IC50值為16.7963μg/mL，S4的IC50值為55.6263μg/mL，S5的IC50值為76.5435μg/mL，S3的IC50值為101.5624μg/mL，S2的IC50值為212.4524μg/mL，進一步說明S4的清除率最大，S5的清除率次之，S2的清除率最小，但均不如Vc。

3.2.2 樣品對羥基自由基的清除能力

圖2 樣品對羥基自由基的清除率Fig.2 Scavenging rate of hydroxyl radical by samples

通過羥基自由基法測得各樣品抗氧化活性，結(jié)果表明：在0～200μg/mL 范圍內(nèi)，樣品的抗氧化活性隨黃酮類化合物濃度的增高而增高，當(dāng)濃度為200μg/mL 時，Vc的清除率為97.68%，S4的清除率為75.72%，S5清除率為65.40%，S3清除率為59.78%，S2清除率為51.32%，其清除率從大到小的順序為：Vc>S4>S5>S3>S2。通過計算IC50得：Vc的IC50值為18.3324μg/mL，S4的IC50值為45.0582μg/mL，S5的IC50值為76.2069μg/mL，S3的IC50值為110.1429μg/mL，S2的IC50值為245.5703μg/mL，進一步說明S4的清除率最大，S5的清除率次之，S2的清除率最小，但均不如Vc。

4 討論

中藥石韋作為一種常用中藥材，近年來被廣泛用于各種復(fù)方制劑中[12，黃酮類化合物作為中藥石韋中一類含量豐富的有效成分，本實驗通過超聲提取法對中藥石韋中黃酮類化合物進行提取；用硝酸鋁比色法測定各樣品中黃酮類化合物含量；通過聚酰胺柱色譜對乙酸乙酯萃取物(S1)進行分離純化。結(jié)果表明黃酮類化合物含量從大到小依次為：S4>S1>S5>S3>S2。通過DPPH法和羥基自由基法測得各樣品抗氧化活性，結(jié)果表明其對DPPH自由基的清除率和對羥基自由基的清除率從大到小都為：S4>S5>S3>S2。其中75%乙醇洗脫獲得的樣品(S4)中的黃酮類化合物含量最高，其抗氧化活性也最強，說明聚酰胺柱對中藥石韋中的黃酮類成分具有較好的富集純化作用；而且，中藥石韋中的黃酮類化合物有較好的抗氧化活性。通過對中藥石韋中黃酮類化合物含量和抗氧化活性的測定，有助于為進一步開發(fā)石韋提供依據(jù)。

[1] 劉燕芳,種貝貝,辛?xí)詡?等.不同產(chǎn)地、不同種類以及不同部位中的石韋總黃酮含量分析[J].中國野生植物資源,2016,35(4):34-39.

[2] 宋立人.現(xiàn)代中藥學(xué)大辭典[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,2001:552.

[3] 段宙位,李維國,竇志浩,等.沉香葉黃酮類化合物的提取及其抗氧化活性[J]. 食品科學(xué),2015(06):45-50.

[4] 李 楠,劉 元,侯濱濱.黃酮類化合物的功能特性[J].食品研究與開發(fā),2005,26(6):139-141.

[5] 李鳳林,李青旺,馮彩寧,等.天然黃酮類化合物提取方法研究進展[J].中國食品添加劑,2008(05):60-64.

[6] 庫詠峰.肉桂總黃酮提取分離分析及抗氧化活性研究[D].南寧：廣西大學(xué),2012.

[7] 唐津忠,魯曉翔,陳瑞芳.金蓮花中黃酮類化合物的提取及其抗氧化性研究[J].食品科學(xué),2003(06):88-91.

[8] 程丹丹,高德民.有柄中藥石韋中多糖提取工藝的優(yōu)化[J].中國野生植物資源,2014,33(3):16-18.

[9] 張 燦,張海暉,武 妍,等.馬蘭黃酮類化合物的提取及其抗氧化活性[J].農(nóng)業(yè)工程學(xué)報,2011(S2):307-311.

[10] 趙春艷.沙蔥中黃酮類化合物的分離純化、結(jié)構(gòu)鑒定及其對小鼠免疫抗氧化機能影響的研究[D].呼和浩特：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué),2008.

[11] 王瑞蘭,易 俗,陳康貴,等.廬山石韋中黃酮的提取工藝研究[J].長沙電力學(xué)院學(xué)報(自然科學(xué)版),2003,18(4):84-85.

[12] 李曉丹.藥用中藥石韋的孢子掃描電鏡鑒定及黃酮化合物的組織化學(xué)定位和測定[D].西安：陜西師范大學(xué),2008.