擬南芥抗病相關基因T1N6_22互作蛋白的酵母雙雜交鑒定

趙亞婷，邢紅俠，龐 茜，鄭 旭，張 靖，甕巧云，2，邢繼紅，董金皋

(1.河北省植物生理與分子病理學重點實驗室，河北農(nóng)業(yè)大學 真菌毒素與植物分子病理學實驗室，河北 保定 071001；2.河北北方學院 農(nóng)林科技學院，河北 張家口 075000)

灰霉病是一種世界性分布的植物病害，其病原為灰葡萄孢(Botrytiscinerea)，主要為害幼果以及成熟的果實、花序、葉片、果柄等，常導致花序、果實大量脫落，已成為嚴重影響我國大田和溫室作物產(chǎn)量和品質(zhì)的重大病害。目前，灰霉病的防治仍以化學防治為主，但由于灰葡萄孢具有遺傳變異大、繁殖速度快、適應性強以及具有多次再侵染等特點，使其對多種不同作用機制的殺菌劑產(chǎn)生了抗藥性，導致殺菌劑的使用量逐年增大，并對農(nóng)產(chǎn)品的安全性造成了嚴重威脅。因此，挖掘植物抗灰霉病基因，深入研究其抗病分子機制，為培育抗灰霉病的作物新品種具有重要意義。近年來，從擬南芥中克隆得到的抗病基因以及抗性相關基因一直是人們研究的熱點。目前，大部分植物抗病基因及抗性相關基因是從擬南芥中獲得的，如RPS2[1-2]、RPS5、RPS6[3]、RPM1[1，4-5]、RPP4[6-7]、RPP7[8]、RPW8[9-12]等，其中部分抗病基因已經(jīng)應用到生產(chǎn)上。研究顯示，植物產(chǎn)生抵抗死體病原菌灰葡萄孢的侵染時，水楊酸(SA)信號途徑發(fā)揮了重要作用，SA的積累可以增加植物對灰葡萄孢的局部抗性[13]。通過高通量轉(zhuǎn)錄組分析，已經(jīng)鑒別了大量植物抵抗灰葡萄孢侵染起作用的轉(zhuǎn)錄因子TFs(Transcription factors)[14-17]。擬南芥T1N6_22基因編碼的蛋白為NAD(P)結(jié)合Rossmann-折疊蛋白家族的成員，具有葡萄糖脫氫酶活性和短鏈氧化還原酶活性，參與植物體內(nèi)各種催化反應和新陳代謝過程，已經(jīng)確定其通過參與SA和茉莉酸(JA)信號途徑調(diào)控擬南芥對灰葡萄孢的抗性[18]。河北農(nóng)業(yè)大學真菌毒素與植物分子病理學實驗室前期獲得了一株對灰葡萄孢敏感的擬南芥突變體，確定了其突變基因為T1N6_22；通過互補回復試驗，明確了T1N6_22基因在擬南芥抗灰霉病過程中起正調(diào)控作用，在擬南芥抗丁香假單胞桿菌(PstDC3000)過程中起負調(diào)控作用；利用酵母雙雜交技術(shù)，以T1N6_22蛋白為誘餌篩選擬南芥的酵母cDNA文庫，獲得了T1N6_22蛋白的候選互作蛋白[19]。但是，T1N6_22蛋白的互作蛋白及其調(diào)控擬南芥抗病的分子機制尚未明確。

本研究利用酵母雙雜交技術(shù)，對擬南芥抗病相關基因T1N6_22的互作蛋白進行鑒定，旨在為進一步明確T1N6_22基因調(diào)控擬南芥抗病的分子機制奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 供試材料

酵母雙雜交載體PGADT7(AD)和PGBKT7(BD)、酵母菌株AH109、擬南芥Columbia生態(tài)型(Col-0)均由河北省植物生理與分子病理學重點實驗室、河北農(nóng)業(yè)大學真菌毒素與植物分子病理學實驗室提供；酵母轉(zhuǎn)化試劑和酵母培養(yǎng)基購于美國Clontech公司；pCR8克隆試劑盒(K2520-20)和LR克隆試劑盒(11791020)購于美國Invitrogen公司。

1.2 T1N6_22基因及其候選互作蛋白基因的擴增

提取擬南芥Columbia生態(tài)型(Col-0)植株的總RNA，總RNA提取方法參照提取試劑盒OMEGA Plant RNA Kit的說明書。以提取的總RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，cDNA的合成方法參照寶生物反轉(zhuǎn)錄試劑盒的說明書。以cDNA為模板，使用T1N6_22基因和AT1G06050、AT1G21400、AT2G19480基因的特異引物進行PCR擴增(表1)。PCR反應體系為MgSO42 μL、10×PCR Buffer 5 μL、dNTP(2.5 mmol/L)1 μL、引物各1 μL、模板cDNA 2 μL、Taq酶0.2 μL，最后加ddH2O至50 μL。PCR程序為94 ℃ 2 min；94 ℃ 15 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35個循環(huán)。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequence

1.3 T1N6_22基因及其候選互作蛋白基因的克隆

將T1N6_22基因及其候選互作蛋白基因的PCR擴增產(chǎn)物進行回收，膠回收方法參照全式金膠回收試劑盒的說明書。將回收的基因擴增產(chǎn)物分別與Gateway克隆載體pCR8進行連接。連接體系為1 μL回收的PCR產(chǎn)物、鹽溶液0.5 μL、ddH2O 1 μL、pCR8 Topo載體0.5 μL，室溫23 ℃反應5 min。連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，挑取陽性克隆進行PCR鑒定和測序驗證。

1.4 T1N6_22基因及其候選互作蛋白基因的酵母雙雜交載體構(gòu)建

利用質(zhì)粒提取試劑盒，提取經(jīng)測序正確的pCR8-T1N6_22、pCR8-AT1G06050、pCR8-AT1G21400和pCR8-AT2G19480質(zhì)粒；利用LR重組試劑盒，將4個基因的入門載體分別與酵母雙雜交載體PGADT7(AD)和PGBKT7(BD)進行重組反應，反應體系為質(zhì)粒pCR8-T1N6_22(或者pCR8-AT1G06050、pCR8-AT1G21400、pCR8-AT2G19480)3 μL、AD/BD載體1 μL、LR克隆酶Ⅱ 1 μL，25 ℃連接2 h。2 h后在連接體系中加入蛋白酶K 1 μL，37 ℃ 10 min。將所得到的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，挑取陽性克隆進行PCR檢測，將PCR檢測正確的克隆進行進一步的測序鑒定。

1.5 T1N6_22基因及其候選互作蛋白基因的自激活活性檢測

將1 μg AD質(zhì)粒分別與1 μg BD-T1N6_22、BD-AT1G06050、BD-AT1G21400和BD-AT2G19480組合共同轉(zhuǎn)化酵母感受態(tài)細胞AH109，室溫孵育1～2 h，42 ℃熱激30 min后，冰浴1～2 min。將酵母細胞涂布于二缺(-Leu/-Trp)培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)2～3 d。挑取二缺培養(yǎng)基上生長良好的酵母單克隆，用100 μL無菌水稀釋，吸取10 μL點于三缺-Leu/-Trp/-His和添加3-AT的-Leu/-Trp/-His培養(yǎng)基上，30 ℃繼續(xù)培養(yǎng)2～3 d，觀察酵母生長情況。

1.6 酵母雙雜交

將1 μg AD-T1N6_22質(zhì)粒分別與1 μg BD-AT1G06050、BD-AT1G21400和BD-AT2G19480質(zhì)粒組合，將1 μg BD-T1N6_22質(zhì)粒分別與1 μg AD-AT1G06050、AD-AT1G21400和AD-AT2G19480質(zhì)粒組合，同時設對照組合AD-T1N6_22+BD、BD-AT1G06050+AD、BD-AT1G21400+AD、BD-AT2G19480+AD、BD-T1N6_22+AD、AD-AT1G06050+BD、AD-AT1G21400+BD和AD-AT2G19480+BD。將不同組合分別轉(zhuǎn)化酵母感受態(tài)細胞(200 μL)，涂布二缺(-Leu/-Trp)培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)2～3 d。挑取二缺培養(yǎng)基上生長良好的酵母單克隆，用100 μL無菌水稀釋，分別吸取10 μL點于二缺-Leu/-Trp、三缺-Leu/-Trp/-His、添加3-AT的三缺-Leu/-Trp/-His 3-AT和四缺-Leu/-Trp/-His/-Ade培養(yǎng)基上，30 ℃繼續(xù)培養(yǎng)2～3 d，觀察酵母生長情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 T1N6_22基因及其候選互作蛋白基因的酵母雙雜交載體構(gòu)建

利用T1N6_22基因的特異性引物擴增得到T1N6_22基因的全長(888 bp)(圖1-A)，將其與入門載體pCR8連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，經(jīng)菌落PCR擴增檢測發(fā)現(xiàn)獲得了單一的目的條帶(圖1-B)，進一步對其進行測序驗證，獲得T1N6_22基因入門載體pCR8-T1N6_22。將pCR8-T1N6_22與酵母雙雜交載體AD、BD進行重組反應，反應產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，經(jīng)菌落PCR鑒定獲得了單一的目的條帶(圖1-C、D)，進一步對重組載體進行測序鑒定，最終獲得T1N6_22基因酵母雙雜交載體AD-T1N6_22和BD-T1N6_22。利用同樣的方法，分別獲得AT1G06050、AT1G21400和AT2G19480基因的酵母雙雜交載體AD-AT1G06050、BD-AT1G06050、AD-AT1G2140、BD-AT1G2140、AD-AT2G19480、BD-AT2G19480(圖2-4)。

A.T1N6_22的PCR擴增；B.pCR8-T1N6_22的PCR擴增；C.AD-T1N6_22的PCR擴增；D.BD-T1N6_22的PCR擴增。A.PCR amplification of T1N6_22；B.PCR amplification of pCR8-T1N6_22；C.PCR amplification of AD-T1N6_22；D.PCR amplification of BD-T1N6_22.

A.AT1G06050的PCR擴增；B.pCR8-AT1G06050的PCR擴增；C.AD-AT1G06050的PCR擴增；D.BD-AT1G06050的PCR擴增。A.PCR amplification of AT1G06050；B.PCR amplification of pCR8-AT1G06050；C. PCR amplification of the AD-AT1G06050；D. PCR amplification of BD-AT1G06050.

A.AT1G21400的PCR擴增；B.pCR8-AT1G21400的PCR擴增；C.AD-AT1G21400的PCR擴增；D.BD-AT1G21400的PCR擴增。A.PCR amplification of AT1G21400；B.PCR amplification of pCR8-AT1G21400；C.PCR amplification of AD-AT1G21400；D.PCR amplification of BD-AT1G21400.

A.AT2G19480的PCR擴增；B.pCR8-AT2G19480的PCR擴增；C.AD-AT2G19480的PCR擴增；D.BD-AT2G19480的PCR擴增。A.PCR amplification of AT2G19480；B. PCR amplification of pCR8-AT2G19480；C. PCR amplification of AD-AT2G19480；D. PCR amplification of BD-AT2G19480.

2.2 T1N6_22基因及其候選互作蛋白基因的自激活活性檢測

將AD空載體分別與BD-T1N6_22、BD-AT1G06050、BD-AT1G21400和BD-AT2G19480質(zhì)粒組合共轉(zhuǎn)化酵母感受態(tài)細胞，檢測各基因的自激活活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，共同轉(zhuǎn)化AD與BD-T1N6_22、BD-AT1G21400和BD-AT2G19480載體的酵母菌落均不能在三缺培養(yǎng)基-Leu/-Trp/-His和-Leu/-Trp/-His 3-AT上生長，共同轉(zhuǎn)化BD-AT1G06050和AD載體的酵母菌落能在三缺(-Leu/-Trp/-His)培養(yǎng)基上正常生長，添加3-AT的三缺培養(yǎng)基-Leu/-Trp/-His 3-AT能夠抑制其生長(圖5)。表明T1N6_22、AT1G21400、AT2G19480基因無自激活活性，AT1G06050基因有自激活活性。

圖 5 T1N6_22及其可能互作蛋白自激活活性的鑒定Fig.5 Self-activating activity of T1N6_22 and its candidate interacting protein

2.3 T1N6_22互作蛋白的酵母雙雜交鑒定

將AD-T1N6_22與BD-AT1G06050、BD-T1N6_22與AD-AT1G06050組合進行酵母雙雜交試驗，同時設AD-T1N6_22+BD、AD+BD-AT1G06050、BD-T1N6_22+AD、BD+AD-AT1G06050、AD+BD組合作為陰性對照。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，共轉(zhuǎn)化AD-T1N6_22與BD-AT1G06050、BD-T1N6_22與AD-AT1G06050組合的酵母菌落在三缺培養(yǎng)基(-Leu/-Trp/-His和-Leu/-Trp/-His 3-AT)和四缺培養(yǎng)基(-Leu/-Trp/-His/-Ade)均能生長，共轉(zhuǎn)化陰性對照AD與BD-AT1G06050組合的酵母菌落在三缺培養(yǎng)基(-Leu/-Trp/-His)上能夠生長，而共轉(zhuǎn)化其他陰性對照組合的酵母菌落在三缺培養(yǎng)基(-Leu/-Trp/-His和-Leu/-Trp/-His 3-AT)和四缺培養(yǎng)基(-Leu/-Trp/-His/-Ade)上均不能生長(圖6)。表明T1N6_22與AT1G06050能在酵母細胞中直接互作。

利用同樣的方法，檢測T1N6_22與AT1G21400、AT2G19480之間在酵母中的互作關系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，共轉(zhuǎn)化AD-T1N6_22+BD-AT1G21400、BD-T1N6_22+AD-AT1G21400、AD-T1N6_22+BD-AT2G19480、BD-T1N6_22+AD-AT2G19480組合的酵母菌落在三缺培養(yǎng)基(-Leu/-Trp/-His和-Leu/-Trp/-His 3-AT)和四缺培養(yǎng)基(-Leu/-Trp/-His/-Ade)上均能生長，而陰性對照組合除BD+AD-AT1G21400和AD+BD在三缺培養(yǎng)基(-Leu/-Trp/-His)上有微弱生長外，其余陰性對照組合均不能在三缺和四缺培養(yǎng)基上正常生長(圖7-8)。表明T1N6_22與AT1G21400、AT2G19480能在酵母細胞中直接互作。

圖 6 T1N6_22 和AT1G06050酵母雙雜交Fig.6 Results of T1N6_22 and AT1G06050 yeast two-hybrid

圖7 T1N6_22 和AT1G21400酵母雙雜交Fig.7 Results of T1N6_22 and AT1G21400 yeast two-hybrid

圖8 T1N6_22 和AT2G19480酵母雙雜交Fig.8 Results of T1N6_22 and AT2G19480 yeast two-hybrid

3 討論

酵母雙雜交系統(tǒng)(Yeast two-hybrid system)是分析蛋白與蛋白之間相互作用的有效、快速的方法，可以精確地測定蛋白質(zhì)之間微弱的相互作用，由于其操作水平是在核酸水平，不需要純化大量的蛋白，因此，操作簡單容易。但是，酵母雙雜交技術(shù)存在一些自身缺陷，很明顯的一個缺陷就是存在假陽性。因此，酵母雙雜交驗證的蛋白質(zhì)相互作用往往還需要其他的試驗證據(jù)進一步支持。本研究中，利用酵母雙雜交技術(shù)確定了T1N6_22蛋白與AT1G06050、AT1G21400和AT2G19480存在互作關系。基于酵母雙雜交系統(tǒng)自身的局限性，后續(xù)試驗中可以采用其他技術(shù)對其互作關系進行進一步的驗證。

除了酵母雙雜交之外，還有多種檢測蛋白互作的方法。如雙分子熒光互補技術(shù)(BiFC)和免疫共沉淀技術(shù)(Co-IP)。其中，BiFC技術(shù)是一個在活細胞中檢測蛋白互作的非常好的工具[20-23]；Co-IP技術(shù)是一種在細胞非變性條件下研究蛋白之間直接互作的方法，可以在體內(nèi)直接確定它們之間相互作用方式的動態(tài)變化[24]。

本研究利用酵母雙雜交技術(shù)確定了T1N6_22蛋白的互作蛋白AT1G06050、AT1G21400和AT2G19480，下一步工作可以對AT1G06050、AT1G21400和AT2G19480的功能進行深入研究，明確其在擬南芥抗病中的功能及其與SA和JA信號途徑之間的關系，深入探討T1N6_22基因及其互作蛋白基因調(diào)控擬南芥抗病的分子機制奠定基礎。

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