沒食子提取物體內外抗炎作用研究

美熱古麗·依米提 竇勤 李治建 斯拉甫·艾白

[摘要] 目的 研究沒食子提取物體內外抗炎作用。 方法 體內以二甲苯致小鼠耳腫脹、角叉菜膠致大鼠足趾腫脹實驗觀察其抗炎作用；體外觀察沒食子提取物對RAW264.7細胞生長曲線和活力以及吞噬中性紅能力的影響；采用酶聯免疫吸附測定法（ELISA）檢測沒食子提取物對脂多糖（LPS）刺激的RAW264.7細胞分泌腫瘤壞死因子α（TNF-α）的影響。 結果 與模型組比較，沒食子提取物能顯著減輕小鼠的耳腫脹度和足趾腫脹（P < 0.05或P < 0.01）；20、40 μg/mL沒食子提取物能活化RAW264.7巨噬細胞，促進RAW264.7細胞增殖，并能增強其吞噬功能；25、50 μg/mL沒食子提取物對LPS誘導的RAW264.7細胞分泌TNF-α有明顯的抑制作用（P < 0.01）。 結論 沒食子提取物具有一定的抗炎作用，可能與抑制促炎介質TNF-α的分泌有關。

[關鍵詞] 沒食子提取物；抗炎作用；RAW264.7細胞；腫瘤壞死因子α

[中圖分類號] R285.5 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2018）02（c）-0008-06

[Abstract] Objective To study the anti-inflammatory effects of Turkish galls extract in vivo and in vitro. Methods The anti-inflammatory effects in vivo were observed through the experiments of mice ear swelling induced by xylene and rats toe swelling induced by carrageenan； the effects of Turkish galls extract for the growth curve and vitality of RAW264.7 cells and phagocytosis of neutral red were observed in vitro； the effects of Turkish galls extract for the secretion of tumor necrosis factor α （TNF-α） in RAW264.7 cells stimulated by lipopolysaccharide （LPS） were detected by enzyme linked immunosorbent assay （ELISA）. Results Compared with model group， Turkish galls extract could significantly reduce the degree of ear swelling and toe swelling （P < 0.05 or P < 0.01）. 20， 40 μg/mL of Turkish galls extract could activate RAW264.7 macrophages， the proliferation of RAW264.7 cells was promoted and their phagocytosis was enhanced. 25， 50 μg/mL of Turkish galls extract had significant inhibitory effects for the secretion of TNF-α in RAW264.7 cells stimulated by LPS （P < 0.01）. Conclusion Turkish galls extract has certain anti-inflammatory effects， which may be related to the inhibition of secretion of pro-inflammatory mediator TNF-α.

[Key words] Turkish galls extract； Anti-inflammatory effects； RAW264.7 cells； Tumor necrosis factor α

沒食子是沒食子蜂科昆蟲沒食子蜂Cynips gallae-tinctoriae Oliv.的幼蟲，寄生于殼斗科植物沒食子樹Quercus infectoria Oliv.幼枝上所產成的蟲癭。沒食子性寒，味苦澀，具有固澀、收斂、燥濕、止血、消炎的作用[1-2]，是維吾爾醫(yī)常用藥材，具有健齒固齦、清血止血、消炎和防腐之功效，被用于治療潰瘍性結腸炎、口腔潰瘍等疾病，療效顯著，臨床上其具有明顯的抗炎、鎮(zhèn)痛作用[3-4]。藥理學研究表明，沒食子具有提高機體非特異性免疫功能，清除自由基和抑制脂質過氧化損傷等作用[3-4]。但其系統(tǒng)的抗炎作用報道較少，本實驗通過研究沒食子提取物的體內外抗炎實驗，體內試驗觀察沒食子提取物對二甲苯致小鼠耳腫脹、角叉菜膠致大鼠足趾腫脹的影響，體外試驗觀察沒食子提取物對RAW264.7細胞生長曲線和活力以及吞噬中性紅能力的影響；進一步觀察采用酶聯免疫吸附測定法（ELISA）檢測沒食子提取物對脂多糖（LPS）刺激的RAW264.7細胞分泌腫瘤壞死因子α（TNF-α）的影響，探討其抗炎作用機制，為臨床用藥提供依據。

1 材料與方法

1.1 藥品

沒食子水提物（批號：20161112），藥材購自新疆奇康哈博維藥有限責任公司。由新疆維吾爾醫(yī)藥研究所希爾艾力主任藥師鑒定為正品。提取方法：取沒食子，粉碎成粗粉，加8倍量水浸泡1 h后，煎煮3次，每次0.5 h，合并煎液，濾過，濾液真空干燥得浸膏，稱重，得率為75%。

地塞米松（濮陽市匯元藥業(yè)有限公司，批號：090603）；吲哚美辛片（開封永康藥業(yè)有限公司，批號：20090409）。

1.2 試劑

二甲苯（天津市紅巖化學試劑廠，批號：200910107）；角叉菜膠（BIO BASIC INC，批號：GS0622b509L）；羧甲基纖維素鈉（CMC-Na，天津市光復精細化工研究所，批號：20081021）；DMEM培養(yǎng)基（高糖，含L-谷氨酰胺，不含碳酸氫鈉，美國GIBCO公司，Exp：12/2010）；PBS（上海生工，Lot：0928P14）；胎牛血清（HYCLONE，美國，Lot：NUK00138）；胰蛋白酶（trypsin，美國Sigma公司，Exp：08/2011）；二甲基亞砜（DMSO，天津市永晟精細化工有限公司，Lot：20070225）；碳酸氫鈉（NaHCO3，上海晶美試劑公司，Lot：20090506）；無水乙醇（天津市富宇精細化工有限公司，Lot：20080821）；培養(yǎng)板（96孔板，美國Costar公司）；小鼠ELISA TNF-α試劑盒（南京建成生物工程研究所，Lot：201006）；LPS（Sigma公司，Exp：201208）。

1.3 動物

昆明小鼠，SPF級，體重（20±2）g，25 d，新疆實驗動物研究中心提供，雌雄各半；SD大鼠，SPF級，180～220 g，45 d，雄，新疆實驗動物研究中心提供，SCXK（新）2011-0002。實驗動物喂養(yǎng)環(huán)境：動物在新疆維吾爾自治區(qū)維吾爾醫(yī)藥研究所SPF級動物房。飼養(yǎng)于塑料籠內，每籠飼養(yǎng)性動物不多于5只，自由飲水，攝食。室溫：20～26℃，相對濕度：40%～70%，光照12 h，實驗開始前經一般觀察。

1.4 細胞株

RAW264.7細胞，購自上海細胞庫。

1.5 主要儀器

XD-101倒置顯微鏡（日本）；BIORAD 550酶標儀（美國）；CO2恒溫培養(yǎng)箱（SANYAO）；37XB型倒置顯微鏡（上海光學六廠）；GBC紫外可見分光光度計；MCO-175 CO2培養(yǎng)箱（日本，Sanyao）。

1.6 方法

1.6.1 體內抗炎試驗

1.6.1.1 沒食子提取物對角叉菜膠致大鼠足跖腫脹影響

SD大鼠72只，體重180～220 g，按照體重分層法隨機分為模型組、吲哚美辛組（7.5 mg/kg）和沒食子高、中、低劑量組（100、50、25 mg/kg），每組12只。模型組給予等體積的0.5% CMC-Na溶液灌胃給藥，其他組分別灌胃給藥，每天1次，共7 d。給藥前以數顯卡尺測定各組右后足厚度，給藥后0.5 h，各鼠在右后足跖中部皮下注射1%角叉菜膠0.1 mL。致炎后1、2、3、4 h測定右后足厚度，計算腫脹度、腫脹率。4 h后處死，將致炎足自踝關節(jié)上0.5 cm處剪下，稱重。腫脹度=右耳片重量-左耳片重量；腫脹率=腫脹度/左耳片重量×100%。

1.6.1.2 沒食子提取物對小鼠耳腫脹的影響

昆明種雄性小鼠60只，體重18～22 g，按照體重分層法隨機分成五組，每組12只，即模型組、地塞米松組和沒食子高、中、低劑量組。地塞米松組以5 mg/kg灌胃給藥；沒食子高、中、低劑量組分別以120、60、30 mg/kg灌胃給藥；模型組給予等體積的0.5% CMC-Na溶液，每天1次。第3天給藥1 h后，乙醚麻醉小鼠，每只小鼠右耳正背面以微量移液器滴涂100%二甲苯致炎，0.02 mL/只，左耳不作處理，1 h后頸椎脫臼處死小鼠，沿耳廓基線剪下雙耳，用直徑為7 mm的打孔器在同一部位打下圓耳片，稱重，計算腫脹度、腫脹率。腫脹度=右耳片重量-左耳片重量，腫脹率=腫脹度/左耳片重量×100%。

1.6.2 體外抗炎試驗

1.6.2.1 沒食子提取物對RAW264.7細胞活力的影響

1.6.2.1.1 MTT法測定沒食子提取物對RAW264.7細胞活力的影響 細胞消化后計數，用培養(yǎng)液稀釋調整為1×104～8×104個/mL，以每孔100 μL接種于96孔板，置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，12 h待細胞完全貼壁后，分為兩組，每個濃度2個復孔，給藥組（沒食子提取物）加入終濃度為25 μg/mL，空白對照組加等體積的培養(yǎng)液，在加藥后的1、2、3、4、5、6、7 d測結果，測定前每孔加100 μL（5 mg/mL）的MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清液，加DMSO 1 mL/孔，吹打使甲臜顆粒充分溶解。吸取200 μL該溶解液至96孔板孔中，在酶標儀上讀取OD值，檢測波長490 nm，繪制細胞生長曲線。

1.6.2.1.2 MTT法測定沒食子對LPS刺激RAW264.7細胞活力的影響 細胞消化后計數，用培養(yǎng)液稀釋調整為1×104～8×104個/mL，以每孔100 μL接種于96孔板，置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，12 h待細胞完全貼壁后，分為四組，沒食子提取物組加入沒食子提取物+LPS終濃度為25 μg/mL，LPS組加10 μg/mL的LPS 10 μL，地塞米松+LPS組加10-7 mmol/mL地塞米松100 μL?？瞻讓φ战M加等體積的培養(yǎng)液，在加藥后的1、2、3、4、5、6、7 d測結果，繪制細胞生長曲線。

1.6.2.1.3 對RAW264.7細胞增殖和吞噬功能的影響 RAW264.7細胞株用含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，調整細胞密度為1×105個/mL（增殖實驗濃度為1×106個/mL），接種于96孔細胞培養(yǎng)板37℃、體積分數5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)6 h后，沒食子濃度為100、50、25、12.5 μg/mL（增殖實驗設濃度為5、10、20、40、80 μg/mL，加藥培養(yǎng)1 h后除空白組其他各孔加10 μg/L的LPS），加藥后置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，棄上清液，加0.075%中性紅溶液，100 μL/孔，培養(yǎng)30 min后，以PBS洗3次，加醋酸-乙醇（1∶1）細胞溶解液，100 mL/孔，于4℃靜置過夜，用酶標儀在570 nm波長處測OD值。

1.6.2.2 沒食子提取物對LPS刺激的RAW264.7細胞分泌TNF-α的影響

培養(yǎng)液為含10%胎牛血清高糖DMEM培養(yǎng)條件為37℃，5%CO2，相對飽和濕度。體外培養(yǎng)RAW264.7細胞到對數生長期，胰酶消化調節(jié)細胞濃度1×105個/mL加入到24孔板中，培養(yǎng)12 h后細胞貼壁，分別加入50、25、12.5 μg/mL的沒食子提取物，陽性對照組加10-7 mmol/mL的地塞米松，1 h后除空白組其他各孔加1 μg/mL的LPS，24 h后取上清液進行測定。細胞上清液1000×g離心10 min去除顆粒和聚合物。嚴格按照說明書的操作進行，試驗結果判定必須以酶標儀讀數為準。

1.7 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 13.0進行統(tǒng)計分析，計量資料以均數±標準差（x±s）表示，采用單因素方差分析（ANOVA）：先進行各組總體比較，若差異無統(tǒng)計學意義則判定各組之間差異無統(tǒng)計學意義；否則繼續(xù)進行給藥組和對照組之間的多對一比較，根據方差齊性檢驗結果，方差齊使用LSD法，方差不齊使用Tamhane's T2法。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 體內抗炎試驗

2.1.1 沒食子提取物對小鼠耳腫脹的影響

地塞米松組、沒食子低劑量組和高劑量組均可抑制二甲苯誘導的小鼠耳腫脹。與模型組比較，地塞米松組腫脹度和腫脹率明顯降低（P < 0.01或P < 0.05）；沒食子低、高劑量組腫脹度明顯降低（均P < 0.05）。見表1。

2.1.2 沒食子提取物對角叉菜膠致大鼠足趾腫脹影響結果

與模型組比較，吲哚美辛組在1～4 h時均可以抑制角叉菜膠致大鼠足趾腫脹（P < 0.01）；沒食子中、低劑量組在1 h時可以抑制角叉菜膠致大鼠足趾腫脹（P < 0.05）。見表2。

2.2 體外抗炎試驗

2.2.1 沒食子提取物對RAW264.7細胞形態(tài)學的影響

對照組的RAW264.7細胞均勻分布，形態(tài)呈梭形或多角形，貼壁牢固，透明度高，形態(tài)正常，折光性強，核分裂相對較多，生長旺盛。與對照組比較，沒食子提取物作用后形態(tài)無差別但部分細胞可見體積變大較多，核分裂較多。LPS組與正常細胞組比較細胞偽足增多，胞體變大。沒食子+LPS組RAW264.7細胞部分皺縮，體積變小，核分裂相較少，聚集成團，折光性差，胞漿內可見大量黑色顆粒，透明度顯著下降，部分漂浮于培養(yǎng)液中，細胞腫脹，部分細胞膜破裂，表明細胞已經壞死。見圖1。

2.2.2 不同藥物對RAW264.7細胞生長曲線的影響

隨著藥物作用時間的延長，不同藥物對RAW264.7細胞增殖速度有明顯差異。正常細胞生長曲線在貼壁24 h細胞潛伏期過后，在2～5 d細胞進入對數生長期，細胞生長加快，在第5～6天細胞進入平臺期（圖2A）。沒食子干預后，細胞生長加快（24～72 h），在第4天細胞開始出現進入平臺期，細胞活性減弱，7 d（圖2B）后生長受到抑制。沒食子+LPS干預細胞，培養(yǎng)1～5 d（圖2C），細胞在第4天生長均受到抑制，細胞活力和增殖能力較正常細胞下降。

2.2.3 沒食子提取物對RAW264.7細胞增殖的影響

從表3中可知，與LPS共同刺激的沒食子提取物20、40 μg/mL組有顯著的增殖作用（P < 0.05），增殖率分別為115.28%和114.89%，80 μg/mL的沒食子作用后沒有明顯的增殖作用。未加LPS組，40、80 μg/mL沒食子提取物對RAW264.7細胞的增殖率都達到130%以上，并且在5～80 μg/mL范圍內沒食子各劑量組對RAW264.7細胞有明顯促進增殖作用（P < 0.05或P < 0.01），呈一定的濃度依賴性。

2.2.4 沒食子提取物對RAW264.7細胞吞噬功能的影響

與空白組TNF-α含量[（57.53±11.31）ng/mL]比較，LPS誘導的RAW264.7細胞分泌TNF-α含量[（76.87±20.74）ng/mL]明顯升高（P < 0.05）；與LPS組比較，沒食子25、50 μg/mL組對LPS誘導的RAW264.7細胞分泌TNF-α升高具有明顯降低作用[沒食子25 μg/mL組：（48.75±19.80）ng/mL；沒食子50 μg/mL組：（36.53±0.47）ng/mL]（P < 0.01），呈明顯的劑量相關性。

3 討論

沒食子含沒食子含有鞣質50%～70%、沒食子酸2%～4%及并沒食子酸[4]、樹脂等。鞣質味澀，具有收斂、抗炎、鎮(zhèn)痛、調節(jié)免疫、降血脂、降血糖[5-20]等作用，維吾爾醫(yī)臨床上常用沒食子治療或緩解潰瘍性結腸炎，以及治療口腔潰瘍的炎癥[21-23]。RAW264細胞是致炎性生物的主要來源之一，包括TNF-α、白介素-6（IL-6）。LPS誘導RAW264細胞釋放TNF-α、IL-6等炎癥因子[24-25]。本研究結果顯示，沒食子提取物能抑制二甲苯所致小鼠耳腫脹；在沒食子提取物的干預下RAW264.7細胞在1～4 d生長明顯加快，干預第4天細胞開始出現進入平臺期，說明沒食子提取物對RAW264.7細胞的增殖能力由促進轉為抑制。在LPS干預下，細胞在1～4 d對數生長期停止生長進入平臺期，沒食子提取物和LPS同時干預細胞，隨著作用時間的延長，細胞增殖受到抑制。沒食子與LPS共同作用細胞后對細胞增殖影響不明顯，單獨作用細胞可促進細胞生長，但隨作用時間的延長由增殖轉為抑制。RAW264.7細胞屬單核/巨噬細胞系，在外源活性物質刺激后，其吞噬率及吞噬速度增高，殺菌、殺瘤能力分泌活性及抗原呈遞能力也增強。由沒食子提取物與RAW264.7增殖、吞噬的關系發(fā)現，其一方面能明顯促進細胞增殖能力和生存能力，具有活化巨噬細胞的作用；另一方面對LPS刺激活化的細胞增殖能力并沒有明顯的促進作用，但是對其吞噬功能有一定的增強作用，從而發(fā)揮著雙向調節(jié)的作用。沒食子提取物對RAW264.7細胞有明顯促進增殖和吞噬功能的作用，能抑制LPS刺激細胞分泌TNF-α，提高巨噬細胞功能，減少內毒素誘導的巨噬細胞致炎細胞因子的釋放，從而減輕患者痛苦。

綜上所述，沒食子提取物具有一定的抗炎作用，可通過抑制促炎介質TNF-α的分泌起到抗炎作用。

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（收稿日期：2017-10-10 本文編輯：張瑜杰）