常規(guī)PCR法擴增口蹄疫病毒基因組5’端序列的探索

朱 研，苗書魁，馬文戈，李金娜，魏玉榮，汪 萍，魏 婕，米曉云，黃 炯

(1新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，烏魯木齊 830052；2.新疆畜牧科學(xué)院獸醫(yī)研究所/新疆畜牧科學(xué)院動物臨床醫(yī)學(xué)研究中心，烏魯木齊 830011)

0 引 言

【研究意義】口蹄疫(foot-and-mouth disease，F(xiàn)MD)被世界動物衛(wèi)生組織(Office International Des Epizooties，OIE)列為法定上報的動物疫病，被我國農(nóng)業(yè)部列為一類疫病[1]?？谔阋卟《?foot-and-mouth disease virus，F(xiàn)MDV)分為O、A、C、SAT1、SAT2、SAT3、AsiaⅠ共7個血清型，目前全球主要流行O型和A型FMD，其次為AsiaⅠ型和SAT2型，其中O型危害最為嚴(yán)重[2]。我國O型FMD主要流行3個拓?fù)湫?，為Cathay 拓?fù)湫?古典中國型)、SEA拓?fù)湫?東南亞拓?fù)湫?和ME-SA拓?fù)湫?中東-南亞拓?fù)湫?。FMDV RNA約由8 500個核苷酸( nucleotides，nt)的無囊膜單股線狀正鏈RNA組成，包括約1 300 nt的5’非編碼區(qū)(5’untranslatedregion，5’UTR) 、約6.5 kb的1個大的開放閱讀框(open reading frame，ORF) 、約90 nt的3’非編碼區(qū)(3’untranslatedregion，3’UTR)及poly(A)組成[3]。在口蹄疫RNA基因組5’末端有一個特殊的小蛋白(VPg)，通過磷酸二酯鍵與尿嘧啶殘基相連[4]。緊接著的5’UTR由1個約360 nt可折疊成莖環(huán)結(jié)構(gòu)的S片段、1個約100-420 nt的聚胞嘧啶poly(C)片段和1個可形成許多二級結(jié)構(gòu)的L片段及其它部分組成[5]，與啟動多聚蛋白的翻譯和病毒的復(fù)制有重要作用[6]。FMDV 5’端二級結(jié)構(gòu)復(fù)雜，且有VPg(3B)蛋白、S片段、poly(C)等的存在，PCR時很難擴增出5’端的序列。試驗用常規(guī)的PCR法擴增5’端的序列，為FMDV反向遺傳學(xué)研究奠定基礎(chǔ)?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】對于FMDV 5’端序列的擴增，研究者采用了不同的方法。有人先提取FMDV的RNA，再將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA，最后擴增出5’端序列[7-9]。自1988年Frohman等報道cDNA末端快速擴增(Rapid Amplification of cDNA Ends，RACE)以來[10]，有學(xué)者[11-12]用5’RACE(Rapid Amplification of cDNA Ends)法成功擴增出FMDV的5’端序列。袁子文等[13]采用融合PCR得到FMDV 5’端序列；仝燕許等[14]以特異性引物反轉(zhuǎn)錄擴增獲得FMDV 5’端的S片段和E片段，再通過融合PCR得到SE片段?！颈狙芯壳腥朦c】通過設(shè)計不同的反轉(zhuǎn)錄引物及擴增引物，采用常規(guī)PCR方法，以不同的擴增酶對FMDV O/Akesu/58 CE39A株的5’末端序列進(jìn)行擴增?！緮M解決的關(guān)鍵問題】探索以更簡便有效的常規(guī)PCR法，擴增出FMDV 5’端序列所需的條件，為RNA病毒 5’端序列的擴增提供參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 病毒及細(xì)胞

新疆畜牧科學(xué)院獸醫(yī)研究所將1958年采自新疆阿克蘇牦牛的一株O型口蹄疫病毒，經(jīng)雞胚傳代馴化39代致弱為安全的毒株，命名為O/Akesu/58 CE39，篩選的單克隆毒株命名為O/Akesu/58 CE39A。O/Akesu/58 CE39A基因組RNA自1990年代由新疆畜牧科學(xué)院獸醫(yī)研究所保存于液氮中。

BHK-21由該實驗室保存，大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α購自天根生化科技(北京)有限公司，pMD19-T Vector購自TaKaRa公司。

1.1.2 主要試劑

LATaqDNA polymerase、EXTaqDNA polymerase、PrimeSTAR?HS DNA polymerase，cDNA Synthesis Kit購自Roche公司。

1.2 方 法

1.2.1 引物設(shè)計

根據(jù)GenBank中O型FMDV全基因組序列(GenBank 登錄號：AJ539138)，設(shè)計5’端反轉(zhuǎn)錄引物(a、b、c)及擴增引物(Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ)，由新疆昆泰銳生物技術(shù)有限公司合成。表1

表1 O/Akesu/58 CE39A株5’端序列的反轉(zhuǎn)錄引物和擴增引物
Table 1 Primers for reverse and amplification of the 5’ terminal sequences of the O/Akesu/58 CE39A strain

引物Primers位置Nucleotideposition序列(5’-3’)Sequences(5’-3’)a3’末端TTTTTTTTTTTTTTTTTTb776AGTTCCCGCGGCCACCATGCTCc2960GGCGTATGCAATCATGTAACGⅠ1F:TTGAAAGGGGGCGTTAGGG767R:CCACCATGCTCCGCTACGAAGⅡ1F:TTGAAAGGGGGCGTTAGGGT776R:AGTTCCCGCGGCCACCATGCTCⅢ1F:TTGAAAGGGGGCGTTAGG782R:TGCTGGGGTTGCACACAT

注：F:上游引物，R：下游引物

Note:

1.2.2 RNA純度測定

取液氮中保存的FMDV O/Akesu/58 CE39A RNA 10 μL，加990 μL ddH2O,混勻，于紫外分光光度計測定其核酸純度。

1.2.3 反轉(zhuǎn)錄

以反轉(zhuǎn)錄引物a、b、c分別進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到擴增模板cDNA1、cDNA2、cDNA3。

1.2.4 5’端序列的擴增

1.2.4.1 采用不同擴增引物及酶對5’端擴增

以cDNA1、cDNA2、cDNA3為模板，分別以擴增引物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ及不同的DNA聚合酶LATaq、 EXTaq、PrimeSTAR對5’端序列進(jìn)行擴增，列出試驗設(shè)計方案。表2

1.2.4.2 常規(guī)PCR退火溫度的優(yōu)化

參照引物合成的建議Tm值，擬設(shè)計退火溫度55、60和65℃對表2試驗分別進(jìn)行擴增，確定最佳Tm。各擴增條件如下：

①94℃預(yù)變性2 min；94℃ 30 s,55℃ 20 s,72℃ 55 s進(jìn)行30個循環(huán)；最后72℃延伸10 min。

②94℃預(yù)變性2 min；94℃ 30 s,60℃ 20 s,72℃ 55 s進(jìn)行30個循環(huán)；最后72℃延伸10 min。

③94℃預(yù)變性2 min；94℃ 30 s,65℃ 20 s,72℃ 55 s進(jìn)行30個循環(huán)；最后72℃延伸10 min。

表2 O/Akesu/58 CE39A株5’末端的擴增
Table 2 Amplification of the 5’ terminal of the O/Akesu/58 CE39A strain

TaqDNA聚合酶TaqDNAPolymerase模板 TemplatescDNA1cDNA2cDNA3LATaqⅠⅠⅠⅡⅡⅡⅢ—ⅢEXTaqⅠⅠⅠⅡⅡⅡⅢ—ⅢPrimeSTARHSⅠⅠⅠⅡⅡⅡⅢ—Ⅲ

1.2.5 目的基因克隆及鑒定

將PCR產(chǎn)物克隆至pMD19-T載體，轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞DH5α，在LB培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，通過酶切及測序鑒定，得到陽性質(zhì)粒。

1.2.6 PCR靈敏度的檢測

對能成功擴增出5’端序列的陽性cDNA以10倍梯度稀釋，稀釋范圍為100～10-6，以這7個濃度的cDNA為模板，取相應(yīng)擴增成功的引物及擴增酶進(jìn)行三組重復(fù)的常規(guī) PCR，同時以無菌去離子水為模板做陰性對照。將擴增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳并拍照，確定模板的最大稀釋度。

2 結(jié)果與分析

2.1 RNA純度測定

以分光光度計測得O/Akesu/58 CE39A株基因組RNA A260/A280為1.871，表明此RNA中可能有部分蛋白質(zhì)或其它有機物的污染，或是完整RNA降解導(dǎo)致純度降低，但在允許范圍1.8～2.0之內(nèi)。

2.2 以不同的模板和酶擴增5’端序列

2.2.1 cDNA1模板擴增結(jié)果

用不同酶及擴增引物對5’端序列進(jìn)行擴增，結(jié)果顯示，以cDNA1為模板，用各擴增酶LATaq、EXTaq、PrimeSTAR及擴增引物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ在55℃、60℃、65℃退火溫度下進(jìn)行PCR，均未擴增出預(yù)期大小條帶。表3

表3 以cDNA1為模板的擴增結(jié)果
Table 3 The results of amplification of cDNA1 template

引物PrimersTaqDNA聚合酶TaqDNAPolymerasePCR程序PCRprocedure是否擴增成功ResultsLATaq①、②、③①否、②否、③否ⅠEXTaq①、②、③①否、②否、③否PrimeSTAR①、②、③①否、②否、③否LATaq①、②、③①否、②否、③否ⅡEXTaq①、②、③①否、②否、③否PrimeSTAR①、②、③①否、②否、③否LATaq①、②、③①否、②否、③否ⅢEXTaq①、②、③①否、②否、③否PrimeSTAR①、②、③①否、②否、③否

2.2.2 cDNA2模板擴增結(jié)果

用不同酶及擴增引物對5’端序列進(jìn)行擴增，結(jié)果表明，以cDNA2為模板，用EXTaq、PrimeSTAR擴增酶及擴增引物Ⅰ、Ⅱ在各退火溫度下進(jìn)行PCR，均未擴增出目的條帶。但在LA酶作用下，兩對引物均擴增出預(yù)期大小條帶。在55及60℃退火溫度下，擴增出的目的條帶與彌散帶混雜，將退火溫度提高至65℃，可擴增出清晰的目的條帶，表明在LA酶下，以cDNA2為模板擴增FMDV 5’端序列的最佳退火溫度為65℃。表4，圖1～3

2.2.3 cDNA3模板擴增結(jié)果

用不同酶及擴增引物對5’端序列進(jìn)行擴增，結(jié)果顯示，以cDNA3為模板，用3種擴增酶及3對擴增引物對5’端進(jìn)行擴增，均未擴增出目的條帶。表5

2.3 重組質(zhì)粒的酶切鑒定

以cDNA2為模板，將LATaqDNA polymerase及擴增引物Ⅰ、Ⅱ下的PCR產(chǎn)物克隆至pMD19-T載體，轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞，提取質(zhì)粒pMD19-T-Ⅰ、pMD19-T-Ⅱ，將質(zhì)粒用BamH Ⅰ和SalⅠ進(jìn)行雙酶切鑒定，設(shè)無插入片段空質(zhì)粒pMD19作為對照，以1%瓊脂糖凝膠電泳分析，均得到預(yù)期大小的條帶，表明該質(zhì)粒為陽性質(zhì)粒。圖4

表4 以cDNA2為模板的擴增結(jié)果
Table 4 The results of amplification of cDNA2 template

引物PrimersTaqDNA聚合酶TaqDNAPolymerasePCR程序PCRprocedure是否擴增成功ResultsLATaq①、②、③①是、②是、③是ⅠEXTaq①、②、③①否、②否、③否PrimeSTAR①、②、③①否、②否、③否LATaq①、②、③①是、②是、③是ⅡEXTaq①、②、③①否、②否、③否PrimeSTAR①、②、③①否、②否、③否

注：M：GeneRuler 1Kb Plus DNA Ladder；1：引物Ⅰ的PCR產(chǎn)物； 2：引物Ⅱ的PCR產(chǎn)物

Note: M: GeneRuler 1Kb Plus DNA Ladder; 1: The PCR products by primer Ⅰ; 2: The PCR products by primer Ⅱ

圖1 引物Ⅰ、Ⅱ在55℃退火溫度下PCR結(jié)果
Fig.1 The PCR results of amplification at 55℃ annealing temperature with primer Ⅰ, primer Ⅱ

注：M：GeneRuler 1Kb Plus DNA Ladder；1：引物Ⅰ的PCR產(chǎn)物； 2：引物Ⅱ的PCR產(chǎn)物

Note: M: GeneRuler 1Kb Plus DNA Ladder; 1: The PCR products by primer Ⅰ; 2: The PCR products by primer Ⅱ

圖2 引物Ⅰ、Ⅱ在60℃退火溫度下PCR結(jié)果
Fig.2 The PCR results of amplification at 60℃ nnealing temperature with primer Ⅰ, primer Ⅱ

注：M：GeneRuler 1Kb Plus DNA Ladder；1：引物Ⅰ的PCR產(chǎn)物；2：引物Ⅱ的PCR產(chǎn)物

Note: M: GeneRuler 1Kb Plus DNA Ladder; 1: The PCR products by primer Ⅰ; 2: The PCR products by primer Ⅱ

圖3 引物Ⅰ、Ⅱ在65℃退火溫度下PCR結(jié)果
Fig.3 The PCR results of amplification at 65℃ annealing temperature with primer Ⅰ, primer Ⅱ

注：M: GeneRuler 1Kb Plus DNA Ladder；1：空質(zhì)粒pMD19-T(2692 bp)；2：pMD19-T-Ⅰ的酶切產(chǎn)物(2692 bp+787 bp)；3：pMD19-T-Ⅱ的酶切產(chǎn)物(2692 bp+797 bp)

Note: M: GeneRuler 1Kb Plus DNA Ladder; 1: Empty plasmid pMD19-T(2692 bp); 2: Digestion of pMD19-T-Ⅰ positive clone(2692 bp+787 bp); 3: Digestion of pMD19-T-Ⅱ positive clone(2692 bp+797 bp)

圖4 O/Akesu/58 CE39A株5’末端重組質(zhì)粒的酶切鑒定
Fig.4 Restriction endonuclease digestion of recombinant plasmid of 5’ termini, O/Akesu/58 CE39A strain表5 以cDNA3為模板的擴增結(jié)果
Table 5 The results of amplification of cDNA3 template

引物PrimersTaqDNA聚合酶TaqDNAPolymerasePCR程序PCRprocedure是否擴增成功ResultsLATaq①、②、③①否、②否、③否ⅠEXTaq①、②、③①否、②否、③否PrimeSTAR①、②、③①否、②否、③否LATaq①、②、③①否、②否、③否ⅡEXTaq①、②、③①否、②否、③否PrimeSTAR①、②、③①否、②否、③否LATaq①、②、③①否、②否、③否ⅢEXTaq①、②、③①否、②否、③否PrimeSTAR①、②、③①否、②否、③否

2.4 重組質(zhì)粒的測序

將酶切鑒定的陽性質(zhì)粒進(jìn)行測序，測序結(jié)果在DNAMAN軟件中進(jìn)行比對，結(jié)果顯示，分別以引物Ⅰ、Ⅱ?qū)/Akesu/58 CE39A株5’末端進(jìn)行擴增，所測得的序列787 bp、797 bp與參考序列(GenBank 登錄號：AJ539138)5’末端的核苷酸同源性為86.2%和86.3%，再次證明得到的質(zhì)粒為陽性質(zhì)粒。

2.5 常規(guī)PCR靈敏度的檢測

以LATaqDNA polymerase為擴增酶，以7個濃度的cDNA2為模板，分別用擴增引物Ⅰ、Ⅱ做常規(guī)PCR。擴增條件如下：94℃預(yù)變性2 min；94℃ 30 s,65℃ 20 s,72℃ 55 s進(jìn)行30個循環(huán)；最后72℃延伸10 min。結(jié)果表明，在引物Ⅰ的電泳圖中，稀釋度≤10-3時能觀測到目的條帶，稀釋度≥10-4時沒有條帶，陰性對照沒有條帶；在引物Ⅱ的電泳圖中觀察到相同的結(jié)果。因此，引物Ⅰ、Ⅱ可檢測到的模板最大稀釋度為10-3。圖5，圖6，表6

注：M: GeneRuler 1Kb Plus DNA Ladder；1：100稀釋度PCR產(chǎn)物；1～7：100～10-6稀釋度PCR產(chǎn)物；8：陰性對照的PCR產(chǎn)物

Note: M: GeneRuler 1Kb Plus DNA Ladder; 1: The PCR product by dilution 100; 1-7: The PCR products by dilution 100-10-6; 8: The PCR products of negative control

圖5 引物Ⅰ在各濃度cDNA2模板下的PCR結(jié)果
Fig.5 The PCR results of each concentration of cDNA2 template with primer Ⅰ

注：M: GeneRuler 1Kb Plus DNA Ladder；1：100稀釋度PCR產(chǎn)物；1～7：100-10-6稀釋度PCR產(chǎn)物；8：陰性對照的PCR產(chǎn)物

M: GeneRuler 1Kb Plus DNA Ladder; 1: The PCR product by dilution 100; 1-7: The PCR products by dilution 100-10-6; 8: The PCR products of negative control

圖6 引物Ⅱ在各濃度cDNA2模板下的PCR結(jié)果
Fig.6 The PCR results of each concentration of cDNA2 template with primer Ⅱ表6 常規(guī)PCR靈敏度測定結(jié)果
Table 6 Results of general PCR for the sensitivity determination

模板濃度Concentrationoftemplate10010-110-210-310-410-510-6引物Ⅰ PrimerⅠ++++---引物Ⅱ PrimerⅡ++++---

3 討 論

口蹄疫病毒分為七個血清型，其中O型以拓?fù)湫捅姸?、免疫原性弱著稱[2]。新疆畜牧科學(xué)院獸醫(yī)研究所于1958年自阿克蘇牦牛分離到一株O型口蹄疫病毒，該毒株被國家口蹄疫參考實驗室命名為O/Akesu/58[15](GenBank 登錄號：AF511039)，新疆畜牧科學(xué)院獸醫(yī)研究所將該毒株經(jīng)雞胚傳代馴化39代致弱為安全的毒株，命名為O/Akesu/58 CE39A，并曾經(jīng)于上世紀(jì)90年代作為弱毒疫苗應(yīng)用于口蹄疫預(yù)防與控制。O/Akesu/58 CE39A基因組與O/Akesu/58核苷酸同源性僅為86.4%，反而與O1/manisa iso87的核苷酸同源性達(dá)到了90.2%。

FMDV基因組5’末端結(jié)構(gòu)復(fù)雜，其5’UTR 360 nt的S片段可形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)，距5’末端約350-500 nt處，有100-420 nt的poly(C)結(jié)構(gòu)，其長度隨毒株的不同而大小不一。在S片段和poly(C)下游可以形成許多高度保守的二級結(jié)構(gòu)，該二級結(jié)構(gòu)由串聯(lián)重復(fù)的假結(jié)(PKs)結(jié)構(gòu)、“發(fā)卡狀”的RNA復(fù)制相關(guān)順式作用元件(cre)結(jié)構(gòu)和內(nèi)部含“三葉草”狀的內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(IRES)構(gòu)成[16]。盡管其它病毒5’端也含有復(fù)雜的二級結(jié)構(gòu)，但只有在FMDV 5’端會同時出現(xiàn)各種結(jié)構(gòu)[17]，導(dǎo)致很難擴增出FMDV 5’端的序列。

5’端序列的擴增，有多種方法可供選用，如5’RACE法和染色體步移法。5’RACE試劑盒包括“去帽法”原理的環(huán)化技術(shù)模板跳轉(zhuǎn)反轉(zhuǎn)錄的SMART RACE技術(shù)、末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(TdT)加尾的錨定RACE等[18]，但這些試劑盒價格昂貴，操作過程繁瑣，對模板的結(jié)構(gòu)要求高[19]，只有對很難擴增的序列，才使用上述RACE試劑盒。染色體步移法包括反向PCR法、連接介導(dǎo)PCR法及特異引物PCR法[20-22]，這些方法操作復(fù)雜，對操作人員的技術(shù)要求較高，成功率較低。近年來，有的學(xué)者通過融合PCR 技術(shù)得到FMDV全長cDNA的克隆，從而獲得5’端的序列[13-14]。試驗選用常規(guī)PCR法，通過不同的擴增酶及不同的反轉(zhuǎn)錄模板、特異性PCR引物對5’端序列進(jìn)行了擴增，該方法不需要耗費大量的時間與精力，操作簡便，價格便宜，適宜條件下擴增成功率較高，可針對性的對5’端的序列進(jìn)行擴增。

DNA聚合酶有多種，每種酶各有其特性。在PCR時，酶的選擇至關(guān)重要，選用不同的酶進(jìn)行擴增，結(jié)果可能截然不同，其最終結(jié)果需要經(jīng)過具體試驗來驗證。由表4可知，在相同模板、引物、PCR條件下，以3種不同的Taq酶進(jìn)行PCR，結(jié)果只有LATaq酶能擴增出目的片段，說明試驗中該酶的擴增能力大于EXTaq和PrimeSTAR。

試驗在參考序列的不同位置(3’末端、776～797、2 960～2 979)設(shè)計了三條反轉(zhuǎn)錄引物，分別反轉(zhuǎn)錄后得到三種模板(cDNA1、cDNA2、cDNA3)，以這三種模板分別進(jìn)行PCR，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，只有以cDNA2為模板，才能擴增出目的片段787 bp和797 bp，787 bp下游引物的位置，與反轉(zhuǎn)錄引物重合了一部分，797 bp下游引物的位置，與反轉(zhuǎn)錄引物位置完全重合。以cDNA1和cDNA3為模板均未擴增出目的片段，表明模板質(zhì)量不夠理想，或者模板長度對其結(jié)構(gòu)有重要影響。

以cDNA為模板的常規(guī)PCR靈敏度檢測表明，兩對引物在模板稀釋度≤10-3時均能擴增出5’端序列，但≥10-4時不能擴增出5’端序列。

試驗在靈敏度檢測時，未能計算出模板的最小拷貝數(shù)，僅確定了模板的最大稀釋度，原因在于，病毒基因組RNA的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中，全長cDNA的拷貝數(shù)未知，且其中含有大量的非全長cDNA和其它殘留物質(zhì)(如殘留的RNA、基因組等)。因此，僅通過反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物濃度的測定和計算稀釋度的方法，并不能確定最大模板稀釋度的PCR反應(yīng)中全長cDNA拷貝數(shù)。試驗使用到的病毒基因組反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物質(zhì)量，影響因素復(fù)雜：第一，F(xiàn)MDV 5’末端結(jié)構(gòu)復(fù)雜，存在莖環(huán)結(jié)構(gòu)、假結(jié)結(jié)構(gòu)等，難于反轉(zhuǎn)錄。第二，RNA質(zhì)量的影響。FMDV RNA為單鏈結(jié)構(gòu)，容易斷裂，所提取的RNA中有斷裂的RNA，直接影響了反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的質(zhì)量；不同批次間RNA質(zhì)量差異也導(dǎo)致反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的質(zhì)量的不同。第三，反轉(zhuǎn)錄酶活性高時反轉(zhuǎn)錄效率高，反之低；第四，反轉(zhuǎn)錄體系的影響。如dNTP易降解，buffer中各成分濃度的影響等。第五，溫度的影響。低溫時會產(chǎn)生非特異條帶，高溫時可能會破壞RNA的二級結(jié)構(gòu)。第六，F(xiàn)MDV RNA長約8 500 nt，基因組長，反轉(zhuǎn)錄引物有可能與模板上其它部位結(jié)合，產(chǎn)生大量非全長cDNA。

試驗采用常規(guī)PCR法擴增FMDV 5’末端序列，通過不同模板、不同擴增酶、不同引物、不同PCR程序之間的比較，確定了擴增5’端序列的最佳條件，為FMDV復(fù)制機理、序列的擴增、結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系、致病機理及宿主嗜性提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。

4 結(jié) 論

常規(guī)PCR法擴增5’端序列較其它技術(shù)具有價格便宜、操作簡便等優(yōu)點。試驗共進(jìn)行了72次PCR，成功6次，成功率為6/72，在成功的6次中，2次擴增出了清晰的目的條帶，其它4次都是目的條帶與彌散帶混雜，表明FMDV 5’端序列的擴增存在很大難度。常規(guī)PCR靈敏度檢測表明，引物Ⅰ、Ⅱ可檢測到的模板最大稀釋度為10-3。

對類似FMDV 5’端難擴增的序列，為了保證模板的質(zhì)量及擴增成功率，設(shè)計反轉(zhuǎn)錄引物時，可盡量在靠近該目的序列的3’端設(shè)計；設(shè)計PCR引物的下游引物時，可與反轉(zhuǎn)錄引物重合，或在靠近反轉(zhuǎn)錄引物的上游設(shè)計。

試驗為FMDV 5’端序列的擴增奠定了基礎(chǔ)，但對FMDV其它血清型及O型血清型其它株5’端序列的擴增，有待進(jìn)一步的探索。

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