基于GEO數(shù)據(jù)庫芯片的早期ST段抬高性心肌梗死標(biāo)志物的篩選及生物信息學(xué)分析

張新春，鄭景輝，莫云秋，寧桂蘭，伍新誠

（廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西 南寧 530001）

急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）是由于心肌缺血引起的面積大小不同的心肌壞死，根據(jù)心電圖ST段改變，臨床上將急性心肌梗死分為ST段抬高型心肌梗死（ST segment elevation myocardial infarction，STEMI）和非ST段抬高型急性心肌梗死（non ST segment elevation acute myocardial infarction，NSTEMI）。由于兩者的發(fā)病機(jī)制不同，所以兩者有不同的臨床表現(xiàn)，且兩者的治療和預(yù)后也有很大區(qū)別[1]。如果能夠早期對STEMI做出診斷，對于提高患者的康復(fù)率具有重要的意義。隨著生物信息學(xué)發(fā)展，產(chǎn)生了大量基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)、脂質(zhì)組學(xué)相關(guān)的大數(shù)據(jù)，并通過生物信息學(xué)分析與計(jì)算機(jī)科學(xué)相結(jié)合的方法對這些數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，可研究多個(gè)基因之間的相互聯(lián)系[2]。本研究檢索GEO數(shù)據(jù)庫中STEMI患者相關(guān)基因芯片，鑒定差異基因，并利用GEO、KEGG等在線數(shù)據(jù)庫系統(tǒng)地分析差異基因的相互關(guān)系及其調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，為深入研STEMI遺傳疾病的分子機(jī)制及早期診斷提供思路。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)集的獲取和資料分析 以“Early Decision of ST-elevation Myocardial Infarction”作為搜索詞，進(jìn)入美國國立生物中心的GEO數(shù)據(jù)庫（http:www.ncbi.nlm.nih.gov/geo）中搜索已公布的STEMI基因芯片數(shù)據(jù)集，獲取一個(gè)數(shù)據(jù)集GSE60993，GSE60993來源于韓國天主教大學(xué)。采用Illumina HumanWG-6 v3.0 expression beadchip平臺，以外周血單個(gè)核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）為研究組織，納入對象為心痛患者，病程不超過4 h，納入共27例患者，其中有7例為STEMI患者，有10例為NSTEMI患者，有10例為非典型性心絞痛患者，并以7名正常人作對照。

1.2 STEMI差異表達(dá)基因的分析 基因差異表達(dá)分析采用GEO數(shù)據(jù)庫的GEO2R在線分析工具進(jìn)行。GEO2R（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r/）是利用R語言程序?qū)蜻M(jìn)行方差分析及t檢驗(yàn)，通過統(tǒng)計(jì)學(xué)方法鑒定差異基因，它是2012年由GEO創(chuàng)立的。將7例ST段抬高性心肌梗死患者樣本作為實(shí)驗(yàn)組，7名正常人樣本作為對照組，分析兩組樣本差異表達(dá)的基因。差異倍數(shù)≥1.5且P＜0.05的基因被視為差異表達(dá)基因。

1.3 篩選出來的差異基因通過DAVID（http://david.abcc.ncifcrf.gov/）數(shù)據(jù)庫中的京都基因與基因組百科全書（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集方法進(jìn)行分析，P值及錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率（false discovery rate，F(xiàn)DR）均≤0.05即視為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的生物通路。string-db數(shù)據(jù)庫進(jìn)行蛋白相互作用分析。

2 結(jié)果

2.1 STEMI患者基因差異表達(dá)分析 首先對各個(gè)樣本的芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理的過程（背景校正，標(biāo)準(zhǔn)化，匯總），根據(jù)圖1可以看出，處理后的芯片數(shù)據(jù)值分布效果較好。按照貝葉斯分析的方法，其中有45個(gè)基因的差異表達(dá)≥1.5倍，其中包含下調(diào)基因1個(gè)、上調(diào)基因44個(gè)，其中芯片ID為：ILMN_2365091、ILMN_1712999、ILMN_1753111、ILMN_1676895 和ILMN_1772131的5個(gè)編號沒有發(fā)現(xiàn)對應(yīng)的基因，ILMN_1804935和ILMN_2387680對應(yīng)的同一個(gè)基因。所以實(shí)際上調(diào)的基因?yàn)?9個(gè)，見表1。

圖1 各樣本芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理的箱體圖Figure 1 Box chart from processing chip data of sample

表1 STEMI患者差異表達(dá)的基因Table 1 Differentially expressed genes in STEMI patients

續(xù)表

2.2 STEMI差異表達(dá)基因的通路分析 通過基因差異表達(dá)分析所篩選出的39個(gè)基因有36個(gè)能夠在KEGG中篩出，富集出TNF signaling pathway和Tuberculosis兩條通路，見表2、圖2、圖3。

表2 差異基因的KEGG通路分析情況Table 2 Analysis of KEGG pathway of differential genes

圖2 TNF signaling pathway信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路示意圖（標(biāo)注五星的位置為本研究中蛋白）Figure 2 map of the TNF signaling pathway(the location of the five stars is the protein in this study)

圖3 Tuberculosis信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路示意圖（標(biāo)注五星的位置為本研究中蛋白）Figure 3 map of the tuberculosis signaling pathway(the location of the five stars is the protein in this study)

2.3 STEMI差異表達(dá)基因的蛋白相互作用分析 通過STRING database數(shù)據(jù)庫進(jìn)行蛋白相互作用之間的分析。發(fā)現(xiàn)相互作用的蛋白主要有IRAK3-DUSP1-FOS-MMP9，S1022A12-QPCT-MME，NAMPT-VNN3，見圖4、表3。

3 討論

早期急性心肌梗死的癥狀不典型，且缺乏心肌梗死典型的心電圖動(dòng)態(tài)演變過程，所以對其診斷有一定難度，而心肌壞死標(biāo)志物在心肌梗死過程早期即發(fā)生改變，所以其對早期急性心肌梗死的臨床診斷有重要意義，已經(jīng)成為當(dāng)前的研究熱點(diǎn)[3]。常見的心肌壞死標(biāo)志物有肌酸激酶同工酶（CKMB）、肌鈣蛋白I（cTnI）、肌紅蛋白（Myo）[4]。臨床上常通過對上述3種心肌壞死標(biāo)志物聯(lián)合檢查來準(zhǔn)確、快速地診斷早期急性心肌梗死[5]。但是臨床這些心肌損傷標(biāo)志物又存在一些不足，比如反映的速度、敏感性、特異性等[6]。

圖4 STRING database數(shù)據(jù)庫蛋白相互作用示意圖Figure 4 diagram of protein interaction by STRING database

表3 STRING database數(shù)據(jù)庫蛋白相互作用注釋表Table 3 Protein interaction annotation by STRING database

本研究中，STMEI和健康對照組的差異基因鑒定利用Gene network，然后通過KEGG在線數(shù)據(jù)庫進(jìn)行生物信息學(xué)分析，選出具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的信號通路。其中之一為TNF signaling pathway，腫瘤壞死因子作為一種重要的細(xì)胞因子，可誘導(dǎo)多種細(xì)胞內(nèi)信號通路，包括細(xì)胞凋亡和細(xì)胞的存活以及炎癥和免疫[7]。TNFR1或TNFR2三聚是配體與受體結(jié)合的復(fù)合體，激活腫瘤壞死因子首先聚合成的三聚體，然后與其受體結(jié)合形成TNFR1或TNFR2三聚。TNFR1也稱腫瘤壞死因子-α，在所有細(xì)胞中均有表達(dá)，是腫瘤壞死因子的主要受體[8]。但TNFR2僅表達(dá)在一些特殊細(xì)胞中，如心肌細(xì)胞、人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞、胸腺細(xì)胞、表達(dá)內(nèi)皮細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)元亞型、CD4+和CD8+T細(xì)胞[9]。TNFR1信號誘導(dǎo)許多基因的活化，由兩個(gè)不同的途徑主要是控制NF-κB通路和MAPK級聯(lián)，或細(xì)胞凋亡和壞死[10]。TNFR2信號激活NF-κB通路包括PI3K依賴NF-κB通路、JNK通路[11]。Tuberculosis信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是結(jié)核病誘發(fā)免疫反應(yīng)該的通路[12]，在急性心肌梗死模型中的蛋白符集在該條通路上，生物信息學(xué)提示STEMI的免疫機(jī)制，值得進(jìn)一步開展研究。

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