藜麥種子總黃酮的提取及體外抑菌作用

董 飛，郭曉農(nóng)

（西北民族大學(xué)科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730000）

藜麥（Chenopodium quinoa）是在安第斯地區(qū)種 植的具有高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的天然食用植物，屬一年生的藜科（Chenopodiaceae）雙子葉草本植物[1-3]。藜麥種子內(nèi)含豐富的黃酮、多種氨基酸、類黃酮、皂苷、和維生素C等多種對(duì)人體有益的化合物。藜麥種子的蛋白質(zhì)以及油脂質(zhì)量分?jǐn)?shù)豐富，至今仍作為安第斯地區(qū)的主要蛋白質(zhì)來(lái)源之一，因此在世界范圍內(nèi)得以普遍種植[4-5]。近年來(lái)，在我國(guó)西北地區(qū)已經(jīng)有一定的適應(yīng)性種植并取得良好成果。2015年由國(guó)家糧食局頒布的LS/T 3245-2015《藜麥米》行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，使我國(guó)的藜麥種植更加科學(xué)和規(guī)范。

黃酮類化合物在多種植物體內(nèi)其含量豐富，且種類多樣，具有多種藥用功效。研究證明，一些植物黃酮類化合物具有抑菌活性，并從中提取分離得到具有廣譜抗菌效果且低毒的黃酮類化合物，豐富了天然抗菌藥物的種類[6]。迄今為止，國(guó)內(nèi)外對(duì)藜麥生理抗逆性相關(guān)研究較多，而藜麥次生代謝產(chǎn)物抑菌活性的研究鮮有報(bào)道[7-10]。我們提取分離藜麥種子總黃酮并研究了其對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、銅綠假單胞菌的抑菌作用，以期為藜麥相關(guān)次生代謝產(chǎn)物的研究及開(kāi)發(fā)利用提供支持。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 原料 指示藜麥品種為隴藜1號(hào)，由甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供。

1.1.2 菌種大腸桿菌（Escherichia coli）、金色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、白色念珠菌（Moniliaalbican）、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）均由西北民族大學(xué)實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.1.3 試劑與藥品 牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基由北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司提供，細(xì)菌級(jí)瓊脂粉由杭州微生物試劑有限公司提供，營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基由青島高科園海博生物技術(shù)有限公司提供，其余試劑均購(gòu)自上海生工有限公司分析純?cè)噭?/p>

1.2 儀器與設(shè)備

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（RE-2000E），上海耀裕儀器設(shè)備有限公司；電子天平（YP1201N），上海精密科學(xué)儀器有限公司；立式壓力蒸汽滅菌器（LDZX-75KB），上海申安醫(yī)療器械廠；恒溫振蕩器（THZ-98AB），上海一恒科學(xué)儀器有限公司；恒溫恒濕箱（HWS-270），寧波東南儀器有限公司；潔凈工作臺(tái)（SW-CJ-2F），蘇州蘇潔凈化設(shè)備有限公司；冰箱（BCD-312WDPV），青島海爾股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 藜麥種子的預(yù)處理 將用蒸餾水沖洗過(guò)后的藜麥種子在60℃烘箱烘24 h，充分干燥[11]，粉碎備用。

1.3.2 脫脂 稱量烘干后的藜麥種子粉末30 g，加入10倍體積（V/m）的石油醚（沸程為60～90℃）浸泡[12]，利用索氏提取器進(jìn)行3次脫脂操作，棄去石油醚，自然揮干后可得到藜麥種子脫脂粉末。

1.3.3 總黃酮的提取 稱取經(jīng)脫脂處理的藜麥種子粉末30 g，按料液質(zhì)量體積比1∶30加入80%乙醇，加熱煮沸回流提取3次，每次1 h，合并3次提取液，然后用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸發(fā)以上合并提取液至原體積的1/4，得到濃縮液。將所得濃縮液于90℃水浴鍋中水浴2 h至葉綠素完全析出，濾除葉綠素沉淀后加3倍體積95%乙醇靜置48 h進(jìn)行醇沉（醇沉3次）以去除雜蛋白[11]，過(guò)濾后用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀加熱濃縮至浸膏備用。

1.3.4 總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測(cè)定 按照標(biāo)準(zhǔn)蘆丁-吸光度測(cè)定法，精密稱取藜麥種子提取物約10 mg，加60%乙醇定容至100 mL，取出0.5 mL置于10 mL具塞試管中，按照蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線制備進(jìn)行操作，以樣品液作空白對(duì)照溶液，于510 nm波長(zhǎng)下測(cè)得樣品吸光度值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線所得的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)方程[9]，可求得藜麥種子的總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)。計(jì)算公式如下：

總黃酮的得率（%）=[（C×V1×V2×10-3）/M]×V0

式中C為測(cè)定樣品的質(zhì)量濃度（g/L）；V0為測(cè)定吸光度所用樣品的體積（mL）；V1為測(cè)定時(shí)的稀釋體積（mL）；V2為樣品定容后的體積（mL）；M為樣品質(zhì)量（g）[1]。

1.4 菌種的活化

分別將金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌、白色念珠菌從4℃冰箱取出自然升溫至室溫，然后接種于牛肉膏蛋白胨斜面培養(yǎng)基上，于37℃恒溫培養(yǎng)箱下培養(yǎng)24 h進(jìn)行活化[13]，于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 菌懸液的制備

用接種環(huán)分別挑取活化后的菌種接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯中，在37℃恒溫震蕩培養(yǎng)箱中震蕩培養(yǎng)10 h后作為原菌液，采用比濁法用0.5麥?zhǔn)媳葷峁軐?duì)比配制菌體懸浮液，用滅菌生理鹽水將各原菌液稀釋，使菌體懸液的菌數(shù)為1×107～8個(gè)/mL。

1.6 藥液配制

嚴(yán)格無(wú)菌操作，用無(wú)菌水將待測(cè)原液依次配制成質(zhì)量濃度分別為 1 024、512、256、128、64、32、16、8、4、2 mg/mL的溶液。

1.7 藜麥種子總黃酮的抑菌實(shí)驗(yàn)

1.7.1 96孔板微量法 取無(wú)菌96孔板，每孔按濃度梯度加入藥液0.1mL，第11個(gè)孔為慶大霉素（8萬(wàn)單位/mL）陽(yáng)性對(duì)照，第12個(gè)孔為不含藥物的無(wú)菌生理鹽水的陰性對(duì)照。此時(shí)各孔的藥物濃度依次為1 024、512、256、 128、 64、 32、16、 8、4、2 mg/mL。再分別向各孔加入稀釋好的菌液0.1 mL[14]，使每孔的最終菌液濃度約為5×106CFU/mL。第1個(gè)孔至第10個(gè)孔的最終藥物濃度分別為512、256、128、64、32、16、8、4、2、1 mg/mL[15]。繼續(xù)將其于37℃下培養(yǎng)18～24 h，觀察肉湯透明度，渾濁說(shuō)明孔內(nèi)有微生物生長(zhǎng)，孔內(nèi)澄清不長(zhǎng)菌時(shí)的最高稀釋度即為該微生物的最低抑菌濃度。陰性對(duì)照孔應(yīng)有微生物生長(zhǎng)，陽(yáng)性對(duì)照孔應(yīng)無(wú)微生物生長(zhǎng)，否則實(shí)驗(yàn)無(wú)效。

1.7.2 牛津杯法[12]吸取各稀釋好的菌液0.2 mL加入營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板，用無(wú)菌三角涂布棒將菌液涂布均勻以制備染菌培養(yǎng)皿。將平板在超凈工作臺(tái)放置3 min，培養(yǎng)皿干燥后待用。所有操作在無(wú)菌的超凈工作臺(tái)內(nèi)嚴(yán)格執(zhí)行。

在無(wú)菌的超凈工作臺(tái)內(nèi)嚴(yán)格操作，在每個(gè)染菌培養(yǎng)皿內(nèi)垂直貼放2個(gè)牛津杯（內(nèi)徑6 mm、外徑8 mm、高10 mm的圓形小管），用無(wú)菌鑷子取經(jīng)高壓滅菌后的牛津杯，輕輕貼放于染菌培養(yǎng)基表面，保證牛津杯與平皿的邊緣相距約10 mm以上，牛津杯間距20 mm以上，牛津杯之間對(duì)稱放置。放好后，輕壓牛津杯上沿使其與培養(yǎng)基接觸無(wú)縫隙，在各牛津杯中加入各濃度的藥液0.1 mL，以加入無(wú)菌生理鹽水0.1 mL作為陰性對(duì)照，同時(shí)選用慶大霉素（市售8萬(wàn)單位/mL）0.1 mL作為陽(yáng)性對(duì)照。每組濃度做3個(gè)平行，蓋好培養(yǎng)皿，做好分類標(biāo)記和日期，置于37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)18～24 h后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)結(jié)果的觀察。觀察抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果并測(cè)量抑菌圈時(shí)，使用數(shù)顯游標(biāo)卡尺對(duì)完全透明且形狀均勻的抑菌圈進(jìn)行測(cè)量，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次取其平均值。若抑菌環(huán)直徑大于8.0 mm，則判為有抑菌作用，反之，則判為無(wú)抑菌作用。陰性對(duì)照應(yīng)沒(méi)有抑菌圈產(chǎn)生，否則判定實(shí)驗(yàn)結(jié)果無(wú)效。

2 結(jié)果與分析

2.1 藜麥種子總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)

通過(guò)圖1曲線可以得到回歸方程A=0.130 9 C-0.106 3（R2=0.995 3）。用標(biāo)準(zhǔn)蘆丁-吸光度測(cè)定法測(cè)得1 mg/mL質(zhì)量濃度的藜麥種子總黃酮提取物的吸光值A(chǔ)為0.039 0，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線可得出藜麥種子總黃酮質(zhì)量濃度為0.017 0 mg/mL，3.825 6 g藜麥種子總黃酮提取物中黃酮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.44%。

圖1 藜麥種子總黃酮質(zhì)量濃度的測(cè)定

2.2 藜麥種子總黃酮的抑菌效果

2.2.1 96孔板微量法 從表1可以看出，藜麥種子總黃酮對(duì)供試微生物有一定的抑制作用，抑菌濃度（MIC值）分別為大腸桿菌32 mg/mL、枯草芽孢桿菌64 mg/mL、銅綠假單胞菌256 mg/mL、白色念珠菌128 mg/mL、金黃色葡萄球菌512 mg/mL。

2.2.2 牛津杯法 由表2可以看出，藜麥種子總黃酮對(duì)幾種供試微生物有一定的抑菌作用，對(duì)大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、銅綠假單胞菌的敏感度不同。并且隨著濃度的降低，其抑菌效果也在逐步降低。由圖2可以看出，藜麥種子總黃酮對(duì)幾種微生物的抑菌效果由大到小依次為大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌。

表1 藜麥種子總黃酮對(duì)幾種微生物的最小抑菌濃度①

表2 藜麥種子總黃酮對(duì)幾種微生物的抑菌圈直徑① mm

圖2 藜麥種子總黃酮對(duì)幾種微生物的抑菌作用

3 小結(jié)與討論

探究了藜麥種子總黃酮金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌、白色念珠菌的抑菌效果，結(jié)果表明，藜麥種子總黃酮對(duì)革蘭氏陰性菌大腸桿菌和革蘭氏陽(yáng)性菌的枯草芽孢桿菌具有良好的抑菌作用，對(duì)革蘭氏陰性菌的銅綠假單胞菌和真菌中的白色念珠菌具有一定的抑菌作用，對(duì)金黃色葡萄球菌基本沒(méi)有抑菌作用。這與其他研究者的結(jié)論并不吻合[16-18]，可能是由于藜麥種子總黃酮成分并不單一，其抗菌活性可能受到多種化學(xué)成分的聯(lián)合效應(yīng)，而一些非活性物質(zhì)有可能相互干擾并影響其抑菌效果，其中有些成分還可成為很好的細(xì)菌培養(yǎng)基成分，促進(jìn)了微生物的生長(zhǎng)。

從植物中提取的天然產(chǎn)物一直以來(lái)備受關(guān)注。張金杰等[19]研究發(fā)現(xiàn)，野菊花中的蒙花苷單體對(duì)葡萄牙假絲酵母的體外抗菌活性較好，楊靜等[20]等在甘草中確定甘草素、甘草查爾酮A為主要抑菌成分，戴航等[21]苦檻藍(lán)葉中分離得到的桔皮素、甜橙素、二氫山柰酚、木犀草素這四種黃酮類化合物具有較好的抑菌活性，楊秀芳等[22]水楊梅中得到的β-谷甾醇、熊果酸、山奈酚、槲皮素、山奈酚-3-O-β-D-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷和胡蘿卜苷對(duì)測(cè)試的5種細(xì)菌具有不同的抑制作用，李晶晶等[23]在牛耳楓果實(shí)中分離出山奈酚并測(cè)定其對(duì)3種植物病原菌的抑菌作用。

藜麥種子中黃酮含量較為豐富，天然黃酮類化合物種類多樣且結(jié)構(gòu)復(fù)雜，但其中究竟是哪種物質(zhì)抑菌活性最強(qiáng)目前尚不明確。本文僅限于對(duì)藜麥種子總黃酮的粗提物抑菌活性的研究，對(duì)藜麥種子總黃酮粗提取物中抑菌活性成分分離純化及其抑菌機(jī)理尚需進(jìn)一步研究探討。

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