黃芪甲苷對異丙腎上腺素誘導(dǎo)大鼠心肌肥厚的保護(hù)作用研究

段立鳴，孫玉紅，王方

心肌肥厚（cardiac hypertrophy，CH）是心臟為維持適當(dāng)收縮功能對各種病理狀態(tài)的一種適應(yīng)性反應(yīng)，然而長期的心肌肥厚可導(dǎo)致擴(kuò)張型心肌病甚至心衰，極大增加了心源性猝死的風(fēng)險(xiǎn)［1］。近年來有研究證實(shí)，氧化應(yīng)激信號分子活性氧（reactive oxygen species，ROS）與病理性心肌肥厚的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，并且異丙腎上腺素（isoproterenol，ISO）誘導(dǎo)的大鼠心肌肥厚過程也是通過ROS途徑實(shí)現(xiàn)的［2］。黃芪做為重要的補(bǔ)氣類中藥，在中醫(yī)臨床治療心肌肥厚中廣泛使用，其主要成分為有多糖、皂苷類等。多項(xiàng)研究證實(shí)，黃芪甲苷對ISO誘導(dǎo)的大鼠心肌肥厚具有一定的保護(hù)作用，主要體現(xiàn)在抗炎、提高機(jī)體免疫功能、降低心肌細(xì)胞鈣離子濃度等方面［3-5］。但黃芪甲苷對心肌肥厚型大鼠的保護(hù)機(jī)制是否與氧化應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)目前尚鮮見報(bào)道，基于以上背景，本研究擬從氧化應(yīng)激反應(yīng)層面作為切入點(diǎn)，探討黃芪甲苷對ISO誘導(dǎo)的心肌肥厚模型大鼠心肌保護(hù)作用的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 健康SPF級SD大鼠24只，體質(zhì)量180～200 g，購自南京醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心；黃芪甲苷購自上海純優(yōu)生物有限公司，純度為98%；ISO購自上海禾豐制藥公司；二氯熒光素雙醋酸鹽（DCFH-DA）、裂解液相關(guān)試劑、BCA及ECL購自Sigma公司；烏拉坦購自上海展云化工有限公司；NADPH氧化酶4（NOX4）抗體、GAPDH抗體及心房鈉尿肽（atrial natriuretic peptide，ANP）抗體購自Novus Biological公司；脫脂奶粉購自BD公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒購自碧云天，聚偏氟乙烯膜（PVDF）購自Millipore公司；顯影、定影劑購自日本柯達(dá)公司；X射線膠片購自富士公司；Trizol試劑、cDNA第一鏈合成試劑盒購自Thermo scientific公司；總RNA提取試劑盒購自天根生化科技有限公司；相關(guān)引物序列委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2 動物分組及處理 大鼠飼養(yǎng)于22～25℃，相對濕度50%～70%的環(huán)境中，每天循環(huán)12h光照，2d后隨機(jī)分為4組：ISO組［ISO 3 mg/（kg·d）腹腔注射，之后與黃芪甲苷組等體積生理鹽水灌胃］、黃芪甲苷組［與ISO組等體積生理鹽水腹腔注射，之后黃芪甲苷溶液5 mg/（kg·d）灌胃］、黃芪甲苷+ISO組［ISO 3 mg/（kg·d）腹腔注射，黃芪甲苷溶液5 mg/（kg·d）灌胃］，對照組（與ISO組等體積的生理鹽水腹腔注射，與黃芪甲苷組等體積生理鹽水灌胃）每組6只，連續(xù)灌胃14d［6］。第14天給藥后禁食12h，稱體質(zhì)量后腹腔注射20%烏拉坦麻醉，開胸取心臟組織，去除大血管及心外膜脂肪組織，去除右心及左心房，保留左心室及室間隔作為左心室的范圍，用預(yù)冷的生理鹽水清洗干凈后濾紙吸干水分，稱取左心室質(zhì)量，計(jì)算左心室質(zhì)量指數(shù)（左心室質(zhì)量/體質(zhì)量）。部分左心室組織置于10%中性福爾馬林中固定，用于組織學(xué)研究（HE染色）；其余組織一部分用于檢測心肌線粒體ROS水平；另一部分立即液氮速凍后轉(zhuǎn)移至-80℃保存，用于Western blot及PCR檢測。

1.3 HE染色 左心室組織經(jīng)10%中性福爾馬林固定，乙醇梯度脫水，常規(guī)石蠟包埋及切片（4 μm），400倍顯微鏡下拍照，每張切片隨機(jī)讀取不少于10個視野，每個視野選取10個心肌細(xì)胞（要求盡量呈圓形），并測量其截面積，應(yīng)用IPP 6.0軟件測量并分析。

1.4 心肌細(xì)胞線粒體ROS生成速率測定 取大鼠左心室組織，采用差速離心法提取線粒體［7-8］，考馬斯亮藍(lán)法測定線粒體蛋白含量。本研究以二氯熒光素（DCF）為探針檢測線粒體ROS生成，二氫二氯熒光素（DCFH）被ROS氧化后，生成的DCF熒光強(qiáng)度隨時間呈線性增加，表明來源于線粒體的ROS以恒定速率產(chǎn)生。取0.5 mg線粒體蛋白，加入測定介質(zhì)（130 mmol/L KCl，5 mmol/L MgCl2，20 mmol/L NaH2PO4，20 mmol/L Tris-HCl，30 mmol/L Glucose，pH=7.4）和底物（啟動呼吸）：2 mmol/L Malate和2 mmol/L Glutamate、5 μmol/L DCFH-DA。首先，測定本底熒光強(qiáng)度隨時間變化的數(shù)據(jù)，計(jì)算線性回歸直線斜率，以反映DCFH自氧化所產(chǎn)生的DCF的熒光強(qiáng)度變化；5 min后，加入線粒體，測定線粒體樣本熒光強(qiáng)度隨時間變化的線性回歸直線斜率；最后計(jì)算ROS生成速率。具體計(jì)算公式：實(shí)際線粒體產(chǎn)生活性氧速率=線粒體樣本熒光強(qiáng)度/時間回歸直線斜率-本底熒光強(qiáng)度/時間回歸直線斜率。線粒體ROS的生成速率單位：fluorescence units/（s·mg）pro，簡寫為u/（s·mg）。

1.5 Western blot法檢測心肌NOX4和ANP表達(dá)水平 取部分凍存心肌組織加入裂解液于冰上勻漿并裂解15 min，4℃、17 500 r/min離心30 min后取上清，BCA法測定蛋白濃度。取100 μg蛋白，70 ℃下水浴5 min，10%SDS-PAGE電泳分離，電轉(zhuǎn)至PVDF膜，3%BSA在37℃下封閉1h，孵育抗NOX4（1∶1 000），抗ANP（1∶1 000），抗GAPDH（1∶5 000）抗體，4 ℃過夜。次日washing液洗滌4次，每次5 min；孵育辣根過氧化酶標(biāo)記的二抗（1∶5 000）120 min后，washing液洗滌3次，每次10 min；最后ECL孵育5 min后曝光，凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行掃描并分析，所得數(shù)據(jù)以內(nèi)參GAPDH做均一化處理后以對照組數(shù)據(jù)作為參照進(jìn)行分析。

1.6 逆轉(zhuǎn)錄實(shí)時熒光定量PCR（RT-qPCR）檢測心肌ANP mRNA的表達(dá)水平 取100 mg心肌組織，按照試劑盒說明提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA后進(jìn)行qPCR，25 μL的反應(yīng)體系包含反應(yīng)液12.5 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各0.75 μL、cDNA 模 板 1 μL，ddH2O 10 μL。 ANP 引 物 ：上 游 5′-TCCTCTTCCTGGCCTTTTGGC-3′，下游 5′-AGACGGGTT?GCTTCCCCAGTC-3′；內(nèi)參β-actin引物：上游5′-TTGCCGA?CAGGATGCAGAAGGA-3′，下游5′-AGGTGGACAGCGAG?GCCAGGAT-3′。反應(yīng)條件：95℃10 min；94℃ 15 s，60℃40 s，40個循環(huán)。通過熔解曲線分析初步鑒定PCR反應(yīng)的特異性。數(shù)據(jù)的收集由Light Cycler 96 system定量儀自帶軟件完成，采用2-ΔΔCt法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，以對照組數(shù)據(jù)作為參照。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)使用SPSS 19.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示；組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 黃芪甲苷對ISO誘導(dǎo)心肌肥厚大鼠左心室質(zhì)量指數(shù)的影響 在給藥14d后，各組大鼠體質(zhì)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=0.52，P＞0.05），但各組間左心室質(zhì)量指數(shù)變化明顯；ISO組左心室質(zhì)量指數(shù)明顯高于對照組，而經(jīng)ISO+黃芪甲苷處理后，左心室質(zhì)量指數(shù)較ISO組明顯下降（P＜0.05）；黃芪甲苷組與對照組相比，左心室質(zhì)量指數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖1。

Fig.1 Comparison of rat left heart index between four groups圖1 各組大鼠左心室質(zhì)量指數(shù)比較

2.2 黃芪甲苷對心肌橫截面積的影響 HE染色結(jié)果顯示ISO組心肌細(xì)胞明顯較對照組肥大，并可見心肌纖維斷裂。ISO組與對照組相比，心肌細(xì)胞橫截面積明顯增大，ISO+黃芪甲苷處理后，大鼠心肌橫截面積較ISO組顯著減小，黃芪甲苷組與對照組相比，大鼠心肌橫截面積差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖2、3。

Fig.2 The results of HE staining of left ventricular tissues in four groups(×400)圖2 各組大鼠左心室組織HE染色結(jié)果（×400）

Fig.3 Comparison of rat myocardial cross-section between four groups圖3 各組大鼠心肌橫截面積比較

2.3 各組心肌線粒體ROS生成速率的變化 各組間ROS速率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=11.74，P＜0.05）。ISO組大鼠心肌線粒體ROS生成速率較對照組顯著增加，而ISO+黃芪甲苷明顯降低了ISO處理后線粒體內(nèi)ROS的生成。黃芪甲苷組與對照組相比，ROS生成速率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖4。

2.4 心肌NOX4表達(dá)變化 與對照組相比，ISO組大鼠心肌NOX4表達(dá)水平顯著增加（P＜0.05）；而經(jīng)過黃芪甲苷處理后，可顯著降低ISO誘導(dǎo)的NOX4的過表達(dá)（P＜0.05）；黃芪甲苷組和對照組相比，NOX4表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖5。

Fig.4 The ROS production rate of myocardial mitochondrial in four groups圖4 各組心肌線粒體ROS生成速率

Fig.5 The protein expression levels of rat myocardial NOX4 in four groups圖5 各組大鼠心肌NOX4表達(dá)水平

2.5 心肌ANP mRNA及蛋白的表達(dá)變化 ISO組心肌ANP mRNA及蛋白表達(dá)水平較對照組明顯升高，而經(jīng)過ISO和黃芪甲苷共同處理后，ANP mRNA及蛋白表達(dá)量較ISO組明顯下降；對照組與黃芪甲苷組ANP mRNA及蛋白表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見圖6、7。

3 討論

心肌肥厚是心臟對人體各種原因刺激（如感染、自身免疫、吸煙等）的一種代償反應(yīng)，在心肌肥厚早期，心功能可以得到一定改善，一定程度上起到保護(hù)心臟的作用，但長期的心肌肥厚可增加心肌耗氧量、降低心肌順應(yīng)性，進(jìn)而導(dǎo)致心力衰竭并增加心源性猝死的風(fēng)險(xiǎn)［9］?？梢?，心肌肥厚嚴(yán)重威脅著人類的生命健康，深入研究心肌肥厚發(fā)病及發(fā)展的病理機(jī)制，尋求有效改善心肌肥厚、保護(hù)心肌的臨床治療策略是當(dāng)前心血管研究領(lǐng)域的重要課題。目前，對于心肌肥厚的治療主要使用β-受體阻滯劑或血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑（ACEI）類藥物、利尿劑及cAMP正性肌力藥物等內(nèi)科治療，外科則主要以左心室輔助裝置及心臟置換等一些方式［10-11］，并已取得一定的臨床療效，但也隨之帶來了諸多不良反應(yīng)。近年來，中藥治療心肌肥厚有著療效確切、安全性高的優(yōu)勢，在臨床中亦廣泛應(yīng)用，尤其以黃芪最為常用。作為黃芪的有效成份之一，黃芪甲苷對心肌肥厚的治療和保護(hù)作用已被越來越多的學(xué)者所重視和研究。

Fig.6 The mRNA expression levels of rat ANP in four groups圖6 各組大鼠ANP mRNA相對表達(dá)水平

Fig.7 The protein expression levels of rat ANP in four groups圖7 各組大鼠ANP蛋白表達(dá)水平

大量研究表明，氧化應(yīng)激是導(dǎo)致心血管系統(tǒng)結(jié)構(gòu)、功能異常的重要原因之一，與其他病理生理機(jī)制相互影響，共同促進(jìn)了心肌肥厚的發(fā)生和發(fā)展［12］。近年來，有研究表明，在過量血管緊張素Ⅱ、去甲腎上腺素、腫瘤壞死因子等神經(jīng)激素影響下，還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）氧化酶被異常激活，促使線粒體產(chǎn)生過量的ROS，在高血壓及心肌肥厚的發(fā)生機(jī)制中起重要作用［13］。作為NADPH氧化酶家族（NOXS）中的一個亞型，NOX4在心肌缺氧、心肌缺血、慢性壓力負(fù)荷的情況下表達(dá)增多［14-15］。MacCarthy等［16］報(bào)道，左心室肥厚心肌組織中內(nèi)皮依賴舒張因子（EDRF）功能受損，導(dǎo)致心肌收縮功能障礙，NADPH氧化酶活性增強(qiáng)，使活性氧生成增多。ANP是由心房肌細(xì)胞合成并釋放的肽類激素，其主要作用是使血管平滑肌舒張和促進(jìn)腎臟排鈉、排水。當(dāng)心房壁受牽拉時（如血量過多、頭低足高位、中心靜脈壓升高和身體浸入水中）均可刺激心房肌細(xì)胞釋放ANP。丁弘等［17］認(rèn)為，ANP表達(dá)與心功能不全密切相關(guān)。

本課題組研究結(jié)果表明，黃芪甲苷可明顯降低ISO誘導(dǎo)的大鼠左心室質(zhì)量指數(shù)的增加，減小心肌橫截面積，并能夠明顯降低線粒體內(nèi)ROS的生成。并且本研究還發(fā)現(xiàn)，在大鼠心肌NOX4表達(dá)水平方面，黃芪甲苷可顯著降低ISO誘導(dǎo)的NOX4的表達(dá)，且經(jīng)過黃芪甲苷預(yù)處理后，ANP mRNA及蛋白表達(dá)量明顯下降，提示黃芪甲苷對心肌肥厚的保護(hù)作用很可能是通過降低NOX4表達(dá)，抑制大鼠心肌氧化應(yīng)激反應(yīng)來實(shí)現(xiàn)的。在未來的心血管疾病治療中，改善氧化應(yīng)激反應(yīng)的藥物可能會成為治療的一個重要環(huán)節(jié)，具有廣闊的研究及應(yīng)用前景。

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