蝎毒多肽干預(yù)CML K562細(xì)胞Hedgehog通路上游活化因子的分子機(jī)制研究

張偉鋒，楊文華

蝎毒多肽提取物（PESV）是中藥全蝎的有效成分［1］。前期研究表明，PESV可以抑制小鼠白血病細(xì)胞的生長、誘導(dǎo)白血病細(xì)胞凋亡，并能降低白血病細(xì)胞的黏附能力，從而抑制白血病的進(jìn)展［2］，但其具體的作用機(jī)制與靶點(diǎn)尚未清晰。Hedgehog（Hh）信號(hào)通路主要存在于人類胚胎發(fā)育時(shí)期，隨著年齡的增長逐漸失去活性［3］。近年來研究表明，腫瘤的發(fā)生與Hh通路的再次活化密切相關(guān)，Hh通路的活化可能導(dǎo)致肝癌、胃癌、乳腺癌等多種腫瘤的發(fā)生［4-5］。其在白血病的發(fā)病中亦起重要作用，Irvine等［6］研究表明，Hh通路與慢性粒細(xì)胞白血?。–ML）的發(fā)病相關(guān)，Hh通路抑制劑可以通過靶向CML干/祖細(xì)胞，提高CML的治療反應(yīng)。本研究旨在為進(jìn)一步探討PESV是否可以通過調(diào)控Hh通路的活化來達(dá)到抑制CML的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料 （1）主要試劑。RPMI 1640、FBS（美國Gibco公司），Trizol kit、PCR試劑盒及SYBR Green熒光燃料MIX（美國Invitrogen公司），反轉(zhuǎn)錄試劑盒RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit（美國MBI公司），兔抗人Shh抗體、兔抗人Smo抗體及兔抗人Ptch抗體（武漢博士德公司），β-actin單克隆抗體（Santa Cruz，USA），HRP標(biāo)記的二抗試劑盒（北京博奧森生物公司），PVDF膜（孔徑為0.22 μm，美國Millipore公司），醫(yī)用X射線膠片（美國柯達(dá)公司）。引物序列，Shh：上游5′-TGCTAGGGATCGGTGGATAG-3′，下游 5′-ACAAGT?CAGCCCAGAGGAGA-3′；Smo：上 游 5′-TGGT?CACTCCCCTTTGTCGTCAC-3′，下游5′-GCACGGTATCGG?TAGTTCTTGTAGC-3′；Ptch：上 游 5′-TTCCAGTTAAT?GACTCCCAAGCAAATG-3′，下游 5′-GCGACACTCTGAT?GAACCACCTC-3′；β-actin：上游 5′-CGTGCTGCTGACC?GAGG-3′，下游5′-GAAGGTCTCAAACATGATCTGGGT-3′。（2）主要儀器。培養(yǎng)瓶、96孔培養(yǎng)板（Corning Incorporated）、超凈工作臺(tái)（蘇凈集團(tuán)）、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱（Thermo Forma）、倒置顯微鏡（Olympus）、電子天平（Sartorius）、微量加樣器（Gilson）、酶標(biāo)儀（BIO-RAD）、低溫離心機(jī)（Sigma）。

1.2 藥物制備 人慢性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞系K562細(xì)胞，由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液學(xué)研究所提供。PESV系將蝎毒粗毒應(yīng)用分子篩層析技術(shù)提純所得，真空干燥后制成干粉，為相對(duì)分子量6 000～7 000的多肽混合物，純度為89.1%；甲磺酸伊馬替尼粉劑（GLEEVEC）由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液學(xué)研究所提供，使用前以生理鹽水溶解，針頭式濾器過濾除菌，稀釋到分組所需濃度。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞的培養(yǎng)及分組處理 常規(guī)復(fù)蘇凍存細(xì)胞，用完全生長培養(yǎng)基在37℃，5%CO2的條件下常規(guī)培養(yǎng)，3～4d傳代一次；收集對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞以1×105/mL濃度接種于24孔培養(yǎng)板，每孔200 μL細(xì)胞懸液，分別加入低、中及高濃度（10、20及40 mg/L）PESV 20 μL（低、中、高劑量組），GLEEVEC（2 g/L）20 μL（GLEEVEC組），生理鹽水20 μL（陰性對(duì)照組），每組均設(shè)3個(gè)復(fù)孔，共培養(yǎng)48h。

1.3.2 Real-time PCR檢測Shh、Smo、Ptch基因mRNA的表達(dá) 取上述細(xì)胞，各自吹打后，用移液器吸取細(xì)胞懸液，置于無菌無RNase的2 mL Eppendorf管中，1 800 r/min離心5 min，用DEPC水配制的l×PBS洗2次，輕柔懸浮細(xì)胞，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度調(diào)整為5.0×105/mL，應(yīng)用Trizol法提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，將獲得的cDNA模板稀釋后用于Real-time PCR，20 μL反應(yīng)體系包含PCR Mixes 10 μL，上下游引物（10 μmol/L）各0.5 μL，cDNA模板2 μL，dH2O 7μL，反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，40個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸5 min。設(shè)β-actin為內(nèi)參，采用2-ΔCt法進(jìn)行定量分析，計(jì)算目的基因與β-actin相對(duì)表達(dá)量，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.3 Western blot檢測Shh、Smo、Ptch蛋白的表達(dá) 收集各組K562細(xì)胞，1 000 r/min離心5 min，1 mL冷PBS重懸計(jì)數(shù)；再次離心后用冷PBS洗滌沉淀2次，1 000 r/min離心5 min并轉(zhuǎn)移至1.5 mL EP管；按1×106細(xì)胞/100 μL的比例加細(xì)胞裂解液，混勻后冰浴放置30 min。4℃，12 000 r/min離心10 min；取上清，應(yīng)用BCA法進(jìn)行蛋白濃度測定。樣本煮沸后，在十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）中進(jìn)行電泳，電泳后轉(zhuǎn)膜，0.5%脫脂牛奶室溫封閉PVDF膜60 min，分別加入Shh、Smo、Ptch一抗4℃孵育過夜，次日1×TBST洗膜3次，加入二抗室溫孵育60 min，1×TBST洗膜3次，加ECL顯影、定影后拍照，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.4 各組K562細(xì)胞BCR/ABL基因mRNA及其融合蛋白P210bcr/abl的表達(dá) 應(yīng)用Real-tmie PCR和Western blot檢測PESV及GLEEVEC對(duì)K562細(xì)胞融合基因及融合蛋白的表達(dá)情況，PCR引物：上游5′-TGTTGACTGGCGTBATGAAGTP?GCTTGG-3′,下游 5′-TTCAGAAGCTTCTCCCTGACAT-3′；β-actin：上游5′-GGCATGGGTCAGAAGGATTCC-3′，下游5′-ATGTCACGCACGATTTCCCGC-3′。實(shí)驗(yàn)步驟同 1.3.2、

1.3.3 ，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，2組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1BCR/ABL融合基因mRNA及P210bcr/abl蛋白的表達(dá) 與陰性對(duì)照組比較，PESV各劑量對(duì)K562細(xì)胞BCR/ABL融合基因mRNA及P210bcr/abl蛋白的表達(dá)均有不同程度的抑制作用，其中高劑量組表達(dá)下降最為明顯（P＜0.05），但低劑量組BCR/ABL融合基因mRNA的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；各劑量組BCR/ABL融合基因mRNA水平和P210bcr/abl蛋白表達(dá)水平均高于GLEEVEC組（P＜0.05），見表1，圖1、2。

2.2Shh、Smo、PtchmRNA的表達(dá) 與陰性對(duì)照組比較，中、高劑量組Shh、Smo、Ptch基因相對(duì)表達(dá)水平均降低，低劑量組僅Smo基因相對(duì)表達(dá)水平降低（P＜0.05）；與GLEEVEC組比較，中、高劑量組Shh、Smo、Ptch基因相對(duì)表達(dá)水平差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表2、圖3。

Tab.1 The mRNA expressions of BCR/ABL gene and P210bcr/ablin five groups表1 各組BCR/ABL融合基因mRNA水平和P210bcr/abl蛋白的表達(dá) （n=3，±s）

Tab.1 The mRNA expressions of BCR/ABL gene and P210bcr/ablin five groups表1 各組BCR/ABL融合基因mRNA水平和P210bcr/abl蛋白的表達(dá) （n=3，±s）

＊＊P＜0.01，a與陰性對(duì)照組比較，b與低劑量組比較，c與中劑量組比較，d與高劑量組比較，P＜0.05

組別陰性對(duì)照組低劑量組中劑量組高劑量組GLEEVEC組F BCR/ABL融合基因mRNA 1.335±0.056 1.209±0.046 0.903±0.062ab 0.837±0.053ab 0.523±0.019abcd 125.947＊＊P210bcr/abl蛋白0.976±0.027 0.823±0.054a 0.701±0.081a 0.643±0.061abc 0.415±0.036abcd 49.041＊＊

Fig.1 BCR/ABL mRNA expressions in five groups圖1 各組BCR/ABL融合基因mRNA

Fig.2 P210bcr/ablexpressions in five groups圖2 各組P210bcr/abl蛋白表達(dá)

Tab.2 The relative expressions of Shh,Smo and Ptch gene mRNA in five groups表2 各組Shh、Smo、Ptch基因mRNA相對(duì)表達(dá)量（n=3，±s）

Tab.2 The relative expressions of Shh,Smo and Ptch gene mRNA in five groups表2 各組Shh、Smo、Ptch基因mRNA相對(duì)表達(dá)量（n=3，±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；a與陰性對(duì)照組比較，b與低劑量組比較，P＜0.05

組別陰性對(duì)照組低劑量組中劑量組高劑量組GLEEVEC組F Shh 1.813±0.316 1.611±0.252 1.134±0.204ab 1.029±0.197ab 0.951±0.217ab 7.144＊Smo 2.136±0.187 1.890±0.096a 1.293±0.076ab 1.214±0.101ab 1.221±0.083ab 41.732＊＊Ptch 0.933±0.051 0.903±0.036 0.557±0.039ab 0.542±0.053ab 0.511±0.046ab 63.829＊＊

Fig.3 Comparison of Shh,Smo and Ptch mRNA expressions between five groups圖3 各組Shh、Smo、Ptch基因mRNA表達(dá)比較

2.3 各組Shh、Smo、Ptch蛋白的表達(dá) 與陰性對(duì)照組比較，中、高劑量組Shh、Smo、Ptch蛋白在K562細(xì)胞中的表達(dá)水平均降低（P＜0.05），低劑量組表達(dá)差異則無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與GLEEVEC組比較，中、高劑量組Shh、Smo、Ptch蛋白相對(duì)表達(dá)水平差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但低劑量組均升高（P＜0.05），見表3、圖4。

Tab.3 The relative contents of Shh,Smo and Ptch proteins in five groups表3 各組Shh、Smo、Ptch蛋白相對(duì)含量（n=3，±s）

Tab.3 The relative contents of Shh,Smo and Ptch proteins in five groups表3 各組Shh、Smo、Ptch蛋白相對(duì)含量（n=3，±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；a與陰性對(duì)照組比較，b與低劑量組比較，P＜0.05

組別Shh/β-actin Smo/β-actin Ptch/β-actin陰性對(duì)照組低劑量組中劑量組高劑量組GLEEVEC組F 0.521±0.053 0.477±0.053 0.356±0.070ab 0.361±0.083ab 0.347±0.079ab 4.134＊0.826±0.088 0.770±0.096 0.601±0.039ab 0.593±0.047ab 0.577±0.046ab 8.816＊0.333±0.057 0.278±0.066 0.203±0.049ab 0.194±0.063ab 0.147±0.042ab 5.199＊

Fig.4 Comparison of Shh,Smo and Ptch protein expressions between five groups圖4 各組Shh、Smo、Ptch蛋白表達(dá)比較

3 討論

K562細(xì)胞是從CML患者中分離的白血病細(xì)胞株，具有Ph染色體及BCR/ABL融合基因的特征性表達(dá)，而后者已被臨床作為CML的重要診療依據(jù)，因此本實(shí)驗(yàn)選擇K562細(xì)胞作為研究載體。Hedgehog信號(hào)通路主要由Hh配體、跨膜受體蛋白Ptc、G蛋白偶聯(lián)受體樣蛋白Smo、核轉(zhuǎn)錄因子蛋白Gli組成；當(dāng)細(xì)胞外存在Hh配體時(shí)，Hh和Ptc的相互作用能解除Ptc對(duì)Smo的抑制作用，使Smo可與相關(guān)受體結(jié)合，抑制蛋白激酶A活性，從而使Gli以全長進(jìn)入到細(xì)胞核中，啟動(dòng)Hh靶基因的表達(dá)［7］。Turner等［8］最新研究表明，Hedgehog通路在CML中高表達(dá)，與本研究結(jié)果一致。

目前，絡(luò)氨酸激酶抑制劑（TKIs）在CML的治療中已經(jīng)發(fā)揮著重要作用。第一代TKI藥物GLEEVEC是CML治療的首選，但臨床仍有相當(dāng)一部分患者對(duì)GLEEVEC不耐受，有血細(xì)胞減少、肝功能損傷、胃腸道反應(yīng)等不良反應(yīng)［9］；雖然這些不良反應(yīng)可能是可控的，但是嚴(yán)重干擾了患者的規(guī)范化治療，影響到患者的長期生存甚至對(duì)TKIs產(chǎn)生耐藥［10］，急需尋求與TKIs療效相當(dāng)或者聯(lián)合應(yīng)用可以減毒增效的藥物，因此，中藥及其提取物成為研究熱點(diǎn)。

PESV的抗白血病效應(yīng)不僅可以通過下調(diào)白血病干細(xì)胞膜上P-gp、細(xì)胞質(zhì)內(nèi)ALDH、PI3K及細(xì)胞核中多藥耐藥基因1（MDR1）、核因子（NF）-κB的表達(dá)水平，增強(qiáng)白血病細(xì)胞對(duì)阿霉素（ADM）的敏感度［11］；還能夠抑制白血病KG1a干細(xì)胞增殖，對(duì)柔紅霉素（DNR）損傷的KG1a干細(xì)胞有誘導(dǎo)凋亡和分化的作用，其機(jī)制可能與上調(diào)KG1a干細(xì)胞的PTEN、tie-2基因表達(dá)有關(guān)［12］，同時(shí)PESV也可以通過抑制模型小鼠體內(nèi)BCR/ABL融合基因及P210bcr/abl表達(dá)水平進(jìn)而阻斷CML的進(jìn)展，但是其相關(guān)作用機(jī)制尚未明確。本研究結(jié)果顯示，PESV可抑制K562細(xì)胞BCR/ABL融合基因及P210bcr/abl蛋白的表達(dá)，中、高劑量組與GLEEVEC組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示PESV雖然可以抑制該融合基因及蛋白的表達(dá)，但抑制程度較GLEEVEC弱。而本課題組前期研究表明PESV對(duì)K562細(xì)胞增殖的抑制與GLEEVEC相當(dāng)，考慮原因可能與PESV的作用靶點(diǎn)復(fù)雜相關(guān)。但關(guān)于Hh信號(hào)通路的研究結(jié)果顯示，其上游活化因子Shh、Smo、Ptch基因的mRNA和蛋白在K562細(xì)胞中均存在高表達(dá)，驗(yàn)證CML的發(fā)病確實(shí)與該通路密切相關(guān)，應(yīng)用PESV干預(yù)之后，Shh、Smo、Ptch的表達(dá)水平均有不同程度的下降，其中PESV中高劑量組與BCR/ABL融合基因靶向藥物GLEEVE效果相當(dāng)，提示PESV可以通過降低上游活化因子的表達(dá)來抑制Hh通路的活化，達(dá)到抗CML的效應(yīng)，且與GLEEVE效應(yīng)相當(dāng)。

CML的Hh通路相關(guān)的研究目前尚處于體外實(shí)驗(yàn)階段，但其取得的良好結(jié)果可以為體內(nèi)實(shí)驗(yàn)提供研究基礎(chǔ)，而PESV和Hh通路在TKIs耐藥的CML方面的研究也需進(jìn)一步探討。

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