聚己內(nèi)酯/海藻酸鈉/殼聚糖材料制備組織工程椎間盤雙相支架

李麒峰，徐寶山，楊強(qiáng)，馬信龍，張楊，郭悅，楊陽，張凱輝，夏金健，張維昊

椎間盤退變引起的腰腿痛是常見病，嚴(yán)重影響人們健康和工作生活，癥狀嚴(yán)重者常需手術(shù)治療，每年都會造成巨額醫(yī)療費(fèi)用和社會負(fù)擔(dān)［1-2］。目前主要治療方法是椎間盤髓核摘除手術(shù)，然而手術(shù)只能緩解癥狀，剩余的不完整椎間盤不能再生，繼發(fā)退變加重，甚至導(dǎo)致突出復(fù)發(fā)，因此探索合適的椎間盤再生修復(fù)措施越來越受到關(guān)注［3］。隨著組織工程技術(shù)的不斷發(fā)展，組織工程椎間盤構(gòu)建為恢復(fù)椎間盤天然結(jié)構(gòu)和生物功能提供了可能，關(guān)鍵因素是選擇理想的支架和種子細(xì)胞。聚己內(nèi)酯（PCL）是一種高分子聚合材料，具有很高的強(qiáng)度和良好彈性，廣泛應(yīng)用于血管、肌腱、軟骨、骨等生物醫(yī)學(xué)材料領(lǐng)域［4］。海藻酸鈉/殼聚糖混合得到的是一種無毒無害、生物相容性良好的注射性水凝膠，已廣泛地應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域［5］。種子細(xì)胞方面，由于椎間盤是纖維軟骨樣組織，且自體椎間盤細(xì)胞來源有限，目前多采用多功能干細(xì)胞作為種子細(xì)胞，人臍帶沃頓膠來源的間充質(zhì)干細(xì)胞（hWJ-MSCs）對供者無損傷，來源充足、免疫原性低、干細(xì)胞含量豐富、體外擴(kuò)增能力強(qiáng)，具有自然向類軟骨細(xì)胞分化的特點(diǎn)，可作為種子細(xì)胞用于椎間盤組織工程的研究［6］。本研究應(yīng)用熔融紡絲法以聚己內(nèi)酯為材料構(gòu)建取向性多孔組織工程纖維環(huán)支架，在其中間注射水凝膠得到雙相支架，復(fù)合人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，通過組織學(xué)觀察、生物相容性研究及力學(xué)分析，評價(jià)構(gòu)建方法的可行性，為構(gòu)建椎間盤提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要材料 （1）實(shí)驗(yàn)組織。經(jīng)由天津醫(yī)院婦產(chǎn)科行剖宮產(chǎn)手術(shù)產(chǎn)婦同意，獲得新鮮無污染人臍帶5段，用于臍帶沃頓膠的取材。（2）主要試劑、儀器。聚己內(nèi)酯顆粒（Sigma-Aldrich，美國）；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清（Gibco，美國）；死活細(xì)胞（Live/Dead）染色試劑（Abcam，英國）；CCK-8細(xì)胞檢測試劑盒（DOJINDO，日本）；海藻酸鈉（化學(xué)純，青島雙成海藻有限公司）；殼聚糖（食用級，青島博智匯力生物科技有限公司）；掃描電子顯微鏡（SEM，Hitachi，日本）；激光共聚焦顯微鏡（Leica，TCS，德國）；酶標(biāo)儀（iMark，Bio Rad，日本）；體式顯微鏡（Leica，S8APO，德國）；冷凍干燥機(jī)（CHRIST，德國）等。

1.2 椎間盤雙相支架的制備 （1）纖維環(huán)（AF）支架的制備：參考文獻(xiàn)［7］采用電加熱熔融紡絲裝置制備纖維管，見圖1A，再經(jīng)80℃加熱器加熱5 s，絲與絲間形成焊點(diǎn)，使纖維管更牢固，達(dá)到理想的力學(xué)特性，然后再經(jīng)切割器將纖維管切成5 mm長的纖維環(huán)，留用實(shí)驗(yàn)。（2）髓核（NP）支架的制備：參考文獻(xiàn)［8］制得氧化海藻酸鈉/羥丙基殼聚糖水凝膠，注入到纖維環(huán)相中央，放在37℃恒溫箱成膠30 min，得到雙相支架，見圖1B，留作實(shí)驗(yàn)備用。

Fig.1 Preparation of intervertebral disc biphasic scaffolds圖1 椎間盤雙相支架的制備

1.3組織工程椎間盤的構(gòu)建 （1）臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的分離與培養(yǎng)。將無菌新鮮的臍帶導(dǎo)入換藥碗中，倒入生理鹽水沖洗2次，盡量洗凈血液，用剪刀將臍帶剪成若干段，剖開一側(cè)臍帶外膜，剔除血管，慢慢剪下沃頓膠放于瓶皿中，并用刀片切成2 mm×2 mm的小塊，Hank’s液漂洗2遍。用0.2%Ⅱ型膠原酶于37℃搖床200 r/min消化2h，利用200目鋼網(wǎng)過濾，1 500 r/min離心10 min，棄掉一半上清，再加Hank’s液，離心10 min，所得的細(xì)胞沉淀用培養(yǎng)液稀釋后，接種到培養(yǎng)瓶中，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3d換液。培養(yǎng)至P2代細(xì)胞待用，見圖2。（2）無菌的雙相支架浸泡培養(yǎng)液過夜。用槍頭吸干培養(yǎng)液，將消化獲得的P2代臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞接種到雙相支架，然后將其置于培養(yǎng)箱孵育2h，使細(xì)胞貼壁，移至48孔板中加入DMEM培養(yǎng)液（20%胎牛血清）培養(yǎng)，每天換液［9］。

Fig.2 P2 generation of umbilical cord mesenchymal stem cells圖2 P2代臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞

1.4 椎間盤雙相支架的性能評估

1.4.1 大體觀察 于體式顯微鏡下觀察雙相支架并照相記錄。

1.4.2 掃描電鏡觀察 將支架切割成厚5 mm、寬6 mm環(huán)狀結(jié)構(gòu)，抽真空，表面噴金處理后，于掃描電鏡下拍照。

1.4.3 支架孔徑、孔隙率測定 孔徑：取多個(gè)掃描電鏡拍照記錄的樣品圖片，每個(gè)樣品隨機(jī)讀取不同位置圖片，分別測量多組不同孔的直徑，用于計(jì)算雙相支架孔徑。孔隙率：將樣品置入盛有乙醇的刻度量筒中，浸泡4h取出樣品，記錄此過程中量筒內(nèi)的體積變化值。根據(jù)公式ε=（V1-V3）/（V2-V3）×100%，V1為未浸入樣品的體積，V2為浸入樣品的體積，V3為取出樣品后的體積，測量5次，取均值。

1.4.4 材料生物相容性檢測 電鏡觀察：細(xì)胞-支架復(fù)合物培養(yǎng)7d后，用4%多聚甲醛固定，梯度乙醇脫水，干燥噴金，掃描電鏡觀察。死活細(xì)胞染色觀察：復(fù)合物培養(yǎng)7d后，吸除培養(yǎng)液，PBS漂洗2遍，加入死活細(xì)胞染液，37℃培養(yǎng)箱孵育30 min，避光后共聚焦顯微鏡下觀察。細(xì)胞增殖能力分析（CCK-8檢測）：復(fù)合物分別培養(yǎng)至第1、3、5、7天后，加入50 μL CCK-8試劑（相當(dāng)于10%培養(yǎng)液量），37℃培養(yǎng)箱孵育4h，避光后酶標(biāo)儀檢測不同時(shí)段光密度（OD）值。

1.4.5 雙相支架力學(xué)性能測試 參考文獻(xiàn)［10］進(jìn)行雙相支架力學(xué)測試，繪制載荷位移曲線，計(jì)算壓縮彈性模量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間多重比較行SNK-q檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 雙相支架形態(tài)及掃描電鏡觀察 顯微鏡下觀察見纖維環(huán)相成規(guī)則多孔結(jié)構(gòu)，髓核相透明均勻，兩者粘連緊密，見圖3A、B。掃描電鏡下可見纖維環(huán)相呈多孔的菱形結(jié)構(gòu)，孔間疊加緊密，髓核相呈多孔結(jié)構(gòu)，見圖3C、D。

Fig.3 Structure of intervertebral disc biphasic scaffolds圖3 椎間盤雙相支架的結(jié)構(gòu)

2.2 支架孔徑、孔隙率測定結(jié)果 纖維環(huán)支架孔徑為（225.6±3.9）μm，孔隙率為（74.17±0.39）%；髓核支架孔徑（205.5±5.2）μm，孔隙率為（85.52±0.48）%。

2.3 生物相容性檢測結(jié)果 掃描電鏡顯示細(xì)胞黏附在支架的不同層面，見圖4A、B；死活細(xì)胞染色可見在雙相支架上細(xì)胞活性良好，見圖4C、D；CCK-8增殖實(shí)驗(yàn)分析結(jié)果顯示，纖維環(huán)相和髓核相細(xì)胞在不同培養(yǎng)時(shí)間OD值比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F分別為111.66和58.63，P＜0.01），提示人臍帶干細(xì)胞在雙相支架有良好的增殖活性，見圖5。

2.4 雙相支架的力學(xué)性能測定結(jié)果 繪得載荷-位移曲線見圖6，壓縮彈性模量為（173.24±44.93）kPa。

3 討論

Fig.4 SEM images and live/dead cell staining of complexes after culturing for 7 days圖4 復(fù)合物培養(yǎng)7d后掃描電鏡和死活細(xì)胞染色圖

Fig.5 Cell metabolic activity curve圖5 細(xì)胞增殖活性曲線

Fig.6 Load-displacement curve圖6 載荷-位移曲線

椎間盤是由位于中央的髓核，外側(cè)的纖維環(huán)以及上下兩側(cè)的軟骨終板組成。髓核是高度水合的凝膠狀組織，其主要成分是水、具有多分散的帶負(fù)電的蛋白聚糖和多種膠原和非膠原蛋白［11］。纖維環(huán)由高度取向的膠原纖維（主要是Ⅰ型膠原）組成交替取向的片層，相互間成角±30°，抵抗中心髓核加壓以及彎曲延伸和側(cè)向彎曲過程中產(chǎn)生的高拉伸應(yīng)力［12］。這種特殊斜交疊層結(jié)構(gòu)賦予纖維環(huán)限制髓核突出、承受復(fù)雜應(yīng)力的功能，使椎間盤能夠有效緩沖震蕩、分散負(fù)荷［13］，組織工程椎間盤應(yīng)該具備這些結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。因此應(yīng)用組織工程策略仿造天然椎間盤的生理結(jié)構(gòu)是當(dāng)前研究的方向。以前期本課題組實(shí)驗(yàn)方法為基礎(chǔ)，本研究用聚己內(nèi)酯/殼聚糖/海藻酸鈉為材料，采用熔融紡絲法和成膠法，仿造天然椎間盤結(jié)構(gòu)和生物力學(xué)構(gòu)建組織工程椎間盤雙相支架，并復(fù)合人臍帶干細(xì)胞驗(yàn)證其生物特性。

理想的組織工程椎間盤支架應(yīng)具備合適的孔徑、高孔隙率和相連的多孔形態(tài)、良好的生物兼容性、適宜的生物降解吸收性、高表面積的三維結(jié)構(gòu)、與植入部位相匹配的力學(xué)強(qiáng)度［14］。本研究制得的組織工程椎間盤雙相支架，孔徑大小適中、孔隙率高，掃描電鏡觀察可見纖維環(huán)相絲間成角60°的規(guī)則多孔結(jié)構(gòu)，髓核相的成多孔形態(tài)，并且有三維結(jié)構(gòu)，這些均符合組織工程椎間盤結(jié)構(gòu)特性。椎間盤雙相支架通過壓縮測試，測得壓縮彈性模量為（173.24±44.93）kPa，其力學(xué)特性要優(yōu)于靜電紡絲、濕法紡絲等紡絲支架，雖然其壓縮彈性模量低于人正常椎間盤（238.7±68.0）kPa，但是隨著體內(nèi)長期力學(xué)刺激、細(xì)胞增多、膠原蛋白的分泌，其壓縮應(yīng)力會達(dá)到正常椎間盤的要求［15］。

本研究中，雙相支架細(xì)胞復(fù)合體體外培養(yǎng)7d后，掃描電鏡顯示人臍帶干細(xì)胞成梭形或球形分布在支架表面，提示其對種子細(xì)胞生長分泌有利。CCK-8增殖檢測和死活細(xì)胞染色顯示人臍帶干細(xì)胞能很好的增殖生長，提示雙相材料無毒性，有良好的生物相容性，可以作為組織工程椎間盤的理想載體。簡而言之，熔融紡絲法和成膠法制備的雙相支架，為構(gòu)建組織工程椎間盤提供新思路，但是干細(xì)胞向椎間盤組織分化及在體內(nèi)外的再生修復(fù)情況仍有待研究。

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