山雞H5N1高致病性禽流感免疫效價(jià)評(píng)估試驗(yàn)

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(1.上海市奉賢區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，上海 奉賢 201400；2.上海欣灝珍禽育種有限公司，上海 奉賢 201403)

0 引言

山雞，俗稱野雞、學(xué)名雉，是一種在我國(guó)廣泛分布的小型鳥類，其外貌絢麗多彩、肉質(zhì)細(xì)嫩鮮美、野味濃郁醇厚、營(yíng)養(yǎng)豐富齊全，具有較高的經(jīng)濟(jì)和觀賞價(jià)值；而且山雞的抗病能力較強(qiáng)，野外生活幾乎無(wú)疾病發(fā)生。

近年來(lái)，隨著社會(huì)發(fā)展和物質(zhì)生活水平的不斷提高，人們對(duì)名特優(yōu)新產(chǎn)品的需求也不斷增長(zhǎng)，而山雞作為其中的典型代表,成為了人們的首選，市場(chǎng)需求與日俱增，人工養(yǎng)殖的規(guī)模和數(shù)量逐年上升；據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，目前國(guó)內(nèi)存欄商品種山雞約200萬(wàn)套，年上市商品肉山雞近億羽、商品山雞蛋約5億枚，成為了特種養(yǎng)殖中規(guī)模最大的品種。

山雞的規(guī)?；斯ゐB(yǎng)殖，有效緩解了市場(chǎng)需求和生態(tài)保護(hù)的壓力，但高密度的人工飼養(yǎng)，在加速山雞抗病能力退化的同時(shí)，也顯著增加了各類疾病的發(fā)生概率，特別是高致病性禽流感等主要疫病，已嚴(yán)重危害了產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。而目前國(guó)內(nèi)還沒有一套專門的山雞高致病性禽流感的免疫程序，也未見系統(tǒng)開展山雞高致病性禽流感免疫抗體消漲規(guī)律研究的報(bào)導(dǎo)，養(yǎng)殖戶基本都是參照家禽的推薦免疫程序進(jìn)行免疫，免疫失敗現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生。為此，作者根據(jù)多年從事山雞養(yǎng)殖和疾病防控的經(jīng)驗(yàn)，經(jīng)過(guò)精心設(shè)計(jì)和組織準(zhǔn)備，開展了一輪針對(duì)山雞H5N1高致病性禽流感全周期免疫效價(jià)的評(píng)估試驗(yàn)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)山雞

上海某大型山雞育種公司1日齡祖代種山雞苗雛1萬(wàn)羽，2016年7月2日出雛；其入孵種蛋為43周齡健康種母山雞所產(chǎn)，并嚴(yán)格按照孵化流程入孵。

種母山雞已按原免疫程序分別于33日齡、69日齡和194日齡實(shí)施重組禽流感病毒H5亞型(Re-6株+Re-8株)二價(jià)滅活疫苗強(qiáng)制免疫。

1.1.2 免疫疫苗

(1)首免。疫苗名稱：重組禽流感病毒H5亞型二價(jià)滅活疫苗(Re-6株+Re-8株)；批準(zhǔn)文號(hào):獸藥生字(2016)150132250；生產(chǎn)商：青島易邦生物工程有限公司；批號(hào)：160960204；有效期：2016年11月11日。

(2)二免。疫苗名稱：重組禽流感病毒H5亞型二價(jià)滅活疫苗(Re-6株+Re-8株)；批準(zhǔn)文號(hào):獸藥生字(2016)150132250；生產(chǎn)商：青島易邦生物工程有限公司；批號(hào)：160960204；有效期：2016年11月11日。

(3)三免。疫苗名稱：重組禽流感病毒H5亞型二價(jià)滅活疫苗(Re-6株+Re-8株)；批準(zhǔn)文號(hào):獸藥生字(2016)150132250；生產(chǎn)商：青島易邦生物工程有限公司；批號(hào)：170320206；有效期：2018年1月23日。

(4)種母雞三免。疫苗名稱：重組禽流感病毒H5亞型二價(jià)滅活疫苗(Re-6株+Re-8株)；批準(zhǔn)文號(hào):獸藥生字(2016)150132250；生產(chǎn)商：青島易邦生物工程有限公司；批號(hào)：160960204；有效期：2016年11月11日。

1.1.3 檢測(cè)試劑

(1)抗原。禽流感病毒H5N1亞型(Re-6株)血凝抑制試驗(yàn)抗原：哈爾濱維科生物技術(shù)開發(fā)公司生產(chǎn)，批號(hào)：2016005，抗原效價(jià)為210。

禽流感病毒H5N1亞型(Re-8株)血凝抑制試驗(yàn)抗原：哈爾濱維科生物技術(shù)開發(fā)公司生產(chǎn)，批號(hào)：2016006，抗原效價(jià)為210。

(2)標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清。禽流感病毒H5N1亞型(Re-6株)HI試驗(yàn)陽(yáng)性對(duì)照血清：哈爾濱維科生物技術(shù)開發(fā)公司生產(chǎn)，批號(hào)：2016002。

禽流感病毒H5N1亞型(Re-8株)HI試驗(yàn)陽(yáng)性對(duì)照血清：哈爾濱維科生物技術(shù)開發(fā)公司生產(chǎn)，批號(hào)：2016001。

(3)標(biāo)準(zhǔn)陰性血清。禽流感病毒H5N1亞型(Re-6株)HI試驗(yàn)陰性對(duì)照血清：哈爾濱維科生物技術(shù)開發(fā)公司生產(chǎn)，批號(hào)：2015005。

禽流感病毒H5N1亞型(Re-8株)HI試驗(yàn)陰性對(duì)照血清：哈爾濱維科生物技術(shù)開發(fā)公司生產(chǎn)，批號(hào)：2015003。

(4)紅細(xì)胞。1%雞紅細(xì)胞懸液：采集無(wú)禽流感和新城疫等抗體的健康公雞全血，與等體積阿氏液混合，用pH值7.2、0.01moL/L PBS液洗滌3次，每次均以2 500～3 000 rpm/min離心5min，洗滌后用PBS液配成1%雞紅細(xì)胞懸液，2℃～8℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)山雞飼養(yǎng)

(1)育雛期飼養(yǎng)方式。0～35日齡為育雛期；雛山雞采用四層疊層式立體育雛籠飼養(yǎng)。

(2)保育期飼養(yǎng)。36～55日齡為保育期，采用雙層階梯式保育籠飼養(yǎng)。

(3)育成期飼養(yǎng)。分育成前期和育成后期二個(gè)階段，其中：56～120日齡為育成前期，采用暗光照地面平養(yǎng)方式飼養(yǎng)；121日齡至開產(chǎn)(一般在190～195日齡)為育成后期，又稱為產(chǎn)蛋準(zhǔn)備期；采用三層疊層單雞單籠式種山雞籠飼養(yǎng)。

(4)種用期。開產(chǎn)至淘汰(一般持續(xù)種用至56周齡全群淘汰)為種用期。采用三層疊層單雞單籠式種山雞籠飼養(yǎng)。

1.2.2 免疫

根據(jù)H5N1高致病性禽流感推薦免疫程序，結(jié)合山雞生理特性和飼養(yǎng)特點(diǎn)，試驗(yàn)過(guò)程沿用該公司原先使用的免疫程序?qū)υ囼?yàn)山雞全群進(jìn)行H5N1高致病性禽流感強(qiáng)制免疫。

(1)首免。33日齡，重組禽流感病毒H5亞型(Re-6株+Re-8株)二價(jià)滅活疫苗，劑量0.2 mL/羽，免疫方式為頸部皮下注射。

(2)二免。69日齡，重組禽流感病毒H5亞型(Re-6+Re-8)二價(jià)滅活疫苗，劑量0.5 mL/羽，免疫方式為胸部肌肉注射。

(3)三免。194日齡，重組禽流感病毒H5亞型(Re-6+Re-8)二價(jià)滅活疫苗，劑量0.5 mL/羽，免疫方式為胸部肌肉注射。

1.2.3 采樣與樣品處理

(1)種母山雞采樣。對(duì)該批試驗(yàn)山雞的上一世代種母山雞，在留取種蛋(43周齡)時(shí)隨機(jī)采取20份血液樣品。

(2)育雛期采樣。對(duì)剛出殼0日齡雛山雞，隨機(jī)抽取20羽苗雛采血；以后每隔10 d隨機(jī)抽取20羽雛山雞采取血樣，共采集0日齡、10日齡、20日齡、30日齡四個(gè)批次、80份血樣；由于雛山雞體型偏小，此期采血可取心臟采血的方法或直接頸動(dòng)脈放血采樣。

(3)育成期及后續(xù)樣品采集。育成期60日齡時(shí)隨機(jī)采取20份血樣，以后每隔30 d在試驗(yàn)山雞群中隨機(jī)采取20份血樣，共采集60日齡、90日齡、120日齡、150日齡、180日齡、210日齡、240日齡、270日齡、300日齡和330日齡等10個(gè)批次、200份血樣。

(4)樣品處理與保存。整個(gè)試驗(yàn)共采集試驗(yàn)山雞14個(gè)批次、280份血液樣品和43周齡種母山雞1個(gè)批次、20份血液樣品，總數(shù)為15個(gè)批次、300份血液樣品；每個(gè)批次樣品在采集后立即分離血清，標(biāo)記后冷凍保存；至全部15個(gè)批次血樣全部采集完成后集中監(jiān)測(cè)。

1.2.4 樣品檢測(cè)

(1)檢測(cè)方法?？贵w檢測(cè)：按照《高致病性禽流感診斷技術(shù)》國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)(GB/T18936-2003)，所有300份血清樣品在同一時(shí)間采用血凝抑制試驗(yàn)(HI)同步進(jìn)行H5亞型Re-6株和Re-8株禽流感抗體檢測(cè)。

(2)評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)。待檢血清樣品經(jīng)血凝抑制試驗(yàn)檢測(cè)，HI滴度效價(jià)≥4 log2判為抗體合格。

2 結(jié)果與分析

2.1 結(jié)果

2.1.1 種母山雞1個(gè)批次樣品免疫抗體檢測(cè)結(jié)果

43周齡種母山雞的20份血樣經(jīng)檢測(cè)，Re-6株抗體全部合格，合格率100%，HI平均值6.85，其中最高值為10 log2；Re-8株抗體有1份樣品不合格，合格率95%，HI平均值4.7，其中最高值為8 log2；詳細(xì)結(jié)果見表1。

表1 種母山雞抗體檢測(cè)結(jié)果匯總表

2.1.2 試驗(yàn)山雞14個(gè)批次樣品抗體檢測(cè)結(jié)果

(1)各批次樣品抗體檢測(cè)HI均值。經(jīng)檢測(cè)，試驗(yàn)山雞14個(gè)批次的樣品中，Re-6株和Re-8株的HI均值最高批次均為210日齡批次，分別達(dá)到11.45 log2和11.6 log2；而HI均值最低的批次，Re-6株為30日齡批次，僅為0.1 log2，Re-8株為10日齡批次，為3.25 log2，詳見表2。 各批次抗體檢測(cè)HI均值的變化(抗體消長(zhǎng))情況見圖1。

表2 試驗(yàn)山雞各批次樣品抗體檢測(cè)HI均值匯總表

圖1 試驗(yàn)山雞各批次樣品抗體檢測(cè)HI均值折線圖

(2)各批次樣品抗體檢測(cè)陽(yáng)性合格結(jié)果。14批次280份樣品抗體檢測(cè)結(jié)果中，Re-6株的抗體陽(yáng)性合格樣品數(shù)為215份，總陽(yáng)性合格率為76.8%；Re-8株的抗體陽(yáng)性合格樣品數(shù)為259份，總陽(yáng)性合格率為92.5%；各批次樣品抗體檢測(cè)陽(yáng)性合格情況見表3。各批次樣品抗體檢測(cè)陽(yáng)性合格變化情況見圖2。

表3 試驗(yàn)山雞各批次樣品抗體檢測(cè)陽(yáng)性合格率匯總表

圖2 各批次樣品抗體檢測(cè)陽(yáng)性合格率變化情況折線圖

2.2 分析

2.2.1 種母山雞免疫抗體分析

從表1可見，43周齡種母山雞的20份血樣中，Re-6株的抗體陽(yáng)性率達(dá)到了100%，且HI平均值達(dá)6.85 log2，高于4 log2的合格標(biāo)準(zhǔn)；Re-8株的抗體陽(yáng)性率為95%，雖然有1份樣品的HI值為0，但群體HI平均值仍達(dá)到4.7 log2，超過(guò)了4 log2的合格標(biāo)準(zhǔn)。

經(jīng)過(guò)3次強(qiáng)制免疫的種母山雞，其H5N1高致病性禽流感Re-6株和Re-8株的免疫抗體HI值較高，抗體陽(yáng)性合格率也達(dá)到了95%以上，超過(guò)了70%的群體合格標(biāo)準(zhǔn)。

2.2.2 試驗(yàn)山雞各階段免疫抗體分析

(1)母源抗體。分析表2和表3發(fā)現(xiàn)，由于種母山雞的免疫抗體水平較高，初生(0日齡)雛雞均獲得了較高的母源抗體，Re-6株和Re-8株的抗體陽(yáng)性率分別達(dá)到100%和95%，與種母山雞的抗體合格率相當(dāng)，而且HI平均值也與種母山雞的HI平均值較接近。但雛山雞母源抗體的消失速度較快，10日齡后Re-6株和Re-8株的母源抗體HI平均值均低于4 log2的合格標(biāo)準(zhǔn)，而且群體的陽(yáng)性合格率也低于了70%的群體合格標(biāo)準(zhǔn)，說(shuō)明此時(shí)的試驗(yàn)雞群已處于高危時(shí)期，應(yīng)予免疫。

由于山雞的個(gè)體較小，目前養(yǎng)殖戶采用的傳統(tǒng)免疫程序均為33日齡左右首免；因此從表2中可以看到，30日齡時(shí)Re-6株的母源抗體幾乎為0 ，圖一中可直觀見到Re-6株 30日齡的抗體HI值已下降至0點(diǎn)；而Re-8株則在10日齡達(dá)到低谷后，在20日齡和30日齡2個(gè)批次的樣品檢測(cè)中，抗體HI值呈現(xiàn)了一個(gè)逐步上升的現(xiàn)象，但此時(shí)試驗(yàn)雞群未曾開展相關(guān)免疫、已未見任何異常，這一現(xiàn)象有待作進(jìn)一步探討。

(2)免疫抗體。從表2和表3中還可看到，試驗(yàn)山雞群33日齡實(shí)施首免后，Re-6株的免疫抗體HI值快速上升至8.9 log2，在第二次免疫后持續(xù)上升至9.3 log2，達(dá)到第一個(gè)高峰值，群體陽(yáng)性合格率達(dá)到100%，但這一較高的HI均值僅維持一個(gè)月左右即呈現(xiàn)快速下降，2個(gè)月后(180日齡)的HI值跌已至1.75 log2的低值，且群體合格率也僅為30%，明顯低于70%的合格標(biāo)準(zhǔn)。

Re-8株的表現(xiàn)則有所不同，其在首免后的免疫抗體快速上升，并在60日齡時(shí)也達(dá)到了第一個(gè)高峰值，且HI均值達(dá)到了10.35 log2、遠(yuǎn)高于Re-6株的8.9 log2，群體陽(yáng)性合格率也先于Re-6株達(dá)到100%，以后Re-8株的抗體水平逐漸穩(wěn)步下降，即使是69日齡加強(qiáng)免疫也未見抗體HI值有明顯的變化，但HI均值下降的速度較慢，4個(gè)月后(180日齡)仍保持在合格標(biāo)準(zhǔn)以上(HI均值為4.95 log2)。

開產(chǎn)前進(jìn)行第二次加強(qiáng)免疫后，Re-6株和Re-8株的HI均值分別達(dá)到了11.45和11.6的高峰值(實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)的最高值為12 log2)，隨后免疫抗體穩(wěn)定且緩慢下降，直至淘汰仍保持較高水平。

(3)雛山雞Re-6和Re-8兩毒株的母源抗體水平較高，但消退較快，在10日齡時(shí)HI均值即低于4 log2的有效保護(hù)標(biāo)準(zhǔn)，而且Re-6株的母源抗體持續(xù)快速下降，在30日齡時(shí)降至0；而Re-8株的抗體在10日齡后表現(xiàn)了一個(gè)異常的反彈，HI均值甚至超過(guò)了初始母源抗體的的水平。

33日齡首免后，兩毒株抗體均快速上升，且Re-6株在二免后有一個(gè)小幅的提升，但免疫抗體在短期穩(wěn)定后的消退速度較快；Re-8株則對(duì)二次免疫無(wú)明顯反應(yīng)，但抗體消退速度較慢、幅度較小，且一直保持在有效保護(hù)標(biāo)準(zhǔn)以上。三免后，二毒株的抗體水平呈現(xiàn)了穩(wěn)定的同步上升和消退趨勢(shì)，且持續(xù)保持較高抗體水平，直至淘汰。

3 討論

(1)試驗(yàn)證明，重組禽流感H5N1雙價(jià)滅活疫苗(Re-6株+Re-8株)對(duì)山雞有較好的免疫作用，兩毒株均表現(xiàn)了良好的免疫反應(yīng)，但Re-6株的免疫抗體在早中期的消退速度較快、維持時(shí)間較短。

(2)種母山雞經(jīng)過(guò)三次強(qiáng)制免疫后，可獲得較高的免疫抗體，并可較好地遺傳給子一代。

(3)試驗(yàn)山雞群雖從種蛋中獲得了較高的母源抗體，但維持時(shí)間較短，10日齡時(shí)其殘留母源抗體已不能有效保護(hù)雞群，建議在10日齡之前應(yīng)實(shí)施高致病性禽流感免疫。

(4)在未實(shí)施高致病性禽流感免疫的情況下，Re-8株檢測(cè)抗體在10日齡后有一個(gè)明顯的反彈過(guò)程，且幅度較大，20日齡和30日齡的HI均值分別達(dá)到了4.95 log2和5.3 log2，原因待查。

(5)二免后的免疫抗體達(dá)到較高水平，但維持時(shí)間不足90d，因此建議在150日齡左右實(shí)施第三次免疫；三免后的抗體水平可有效保護(hù)雞群5個(gè)月以上，直至淘汰。

(6)根據(jù)本次試驗(yàn)相關(guān)研究結(jié)果，推薦山雞高致病性禽流感免疫程序見表4。

表4 推薦山雞高致病性禽流感免疫程序

注：根據(jù)農(nóng)業(yè)部文件精神，從2017年9月開始將H5N1高致病性禽流感疫苗調(diào)整為重組禽流感病毒(H5+H7)二價(jià)滅活疫苗

衛(wèi)龍興(1965- )，男，上海奉賢人，本科，高級(jí)獸醫(yī)師，主要從事重大動(dòng)物疫病防控、特養(yǎng)動(dòng)物良種選育與技術(shù)推廣等工作。