半自動連續(xù)發(fā)酵殘次鮮紅棗醋及其有機酸分析

向進樂

關(guān)隨霞1,3

馬麗蘋1,2,3

任廣躍1,2

袁云霞1,2

康懷彬1,2

(1.河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，河南 洛陽 471023；2.河南省食品原料工程技術(shù)研究中心，河南 洛陽 471023；3.洛陽市微生物發(fā)酵工程技術(shù)研究中心，河南 洛陽 471023)

棗(ZizyphusjujubeMill.)為鼠李科(Rhamnaceae)棗屬(ZizyphusMill.)植物，原產(chǎn)于中國，已有4 000多年的栽培歷史。棗樹為多花植物，落花落果現(xiàn)象嚴重[1-2]。另外，棗果易開裂，在紅棗生長期即使不易開裂品種，裂果率也有15%左右；成熟期多雨的年份，其裂果率可達50%～80%；紅棗的優(yōu)質(zhì)率較低，殘、次、落果率較高[2]。在臨近收獲期如遇到連陰雨天氣，會在很短時間內(nèi)產(chǎn)生大批的裂棗和落果[2]。鮮棗的加工利用基本都是優(yōu)質(zhì)棗，大多通過干燥制成商品進入市場，優(yōu)質(zhì)干棗價格較高。殘次鮮棗往往由于商品價值低，未能及時有效處理而變成了農(nóng)業(yè)廢棄物。

而殘次棗和優(yōu)質(zhì)棗同樣具有含糖量高的優(yōu)點，開發(fā)天然發(fā)酵食品極具優(yōu)勢[3-4]。李藝偉等[5]以殘次干紅棗為原料，經(jīng)加水浸提制得棗汁，利用棗汁培養(yǎng)可食性酵母菌生產(chǎn)風(fēng)味型酵母味素作為食品調(diào)味劑，為提高殘次紅棗加工利用率提供了思路。張寶善等[6]以陜北殘次干棗為原料，研究不同發(fā)酵方式對紅棗醋品質(zhì)、生產(chǎn)周期以及生產(chǎn)自動化程度等方面的影響，為殘次紅棗加工棗醋的可行性提供理論依據(jù)?？梢钥闯?，目前利用殘次棗加工發(fā)酵食品基本上是先將殘次棗干制后再加水制汁發(fā)酵或帶皮渣發(fā)酵。但是干制需要消耗大量熱量，同時也會加重鮮棗中營養(yǎng)、保健成分的破壞[7]。殘次棗如果能以鮮棗形式大批量、快速加工生產(chǎn)棗產(chǎn)品，將會節(jié)約大量能源，并能減少紅棗資源浪費。

楊建紅等[8]以鮮紅棗為原料，用植物乳桿菌與酵母協(xié)同完成酒精發(fā)酵，接種醋酸菌后搖床培養(yǎng)發(fā)酵制得棗醋樣品，對鮮棗直接發(fā)酵果醋進行了有益嘗試。但是，這些研究的鮮棗處理量非常小，僅限于實驗室研究。本研究以河南新鄭棗區(qū)的殘次鮮棗為原料，采用半自動連續(xù)發(fā)酵生產(chǎn)棗醋，探討利用殘次鮮棗快速發(fā)酵生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)棗醋的可行性，以期為殘次鮮棗的快速處置和資源化利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

殘次鮮棗：采自新鄭市孟莊鎮(zhèn)；

酵母菌：湖北安琪酵母股份有限公司；

醋酸菌：上海中科伍佰豪生物有限公司；

有機酸標(biāo)品(蘋果酸、酒石酸、檸檬酸等)：天津科密歐化學(xué)試劑有限公司；

3,5-二硝基水楊酸、2,4-二硝基苯肼、葡萄糖、氫氧化鈉、鹽酸、濃硫酸等：分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

分光光度計：UV-2350型，優(yōu)尼科(上海)儀器有限公司；

離心機：TGL-20M型，湖南湘儀離心機儀器有限公司；

榨汁機：ZJ145型，廣東恒聯(lián)食品機械有限公司；

液體發(fā)酵罐：HND-GQ-4.5型，鎮(zhèn)江匯能達生物工程設(shè)備有限公司；

高效液相色譜儀：LC-15C型，CTO-15C 柱溫箱，LC-15C泵，SIL-10AF 自動進樣器，SPD-15C紫外檢測器，島津中國有限公司；

色譜柱：Wondasil C18，4.6 mm × 250 mm，5 μm，島津中國有限公司。

1.3 檢測方法

1.3.1 總可溶性固形物(TSS)、pH值、酒精、總酸以及水分含量測定 樣品TSS用手持糖度計測定；pH值用pH計法；發(fā)酵液酒精度用酒精計法；總酸采用酸堿滴定法測定；水分含量按GB 5009.3—2010執(zhí)行。

1.3.2 總VC以及還原糖含量測定 總VC用2,4-二硝基苯肼法，按GB/T 5009.86—2003執(zhí)行；標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：y=0.025 1x+0.001 4，R2=0.995 5，樣品測定與計算參照GB/T 5009.86—2003。還原糖以3,5-二硝基水楊酸比色法測定[9]，以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)物，標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：y=0.442 7x-0.016 3(R2=0.991 2)；樣品按標(biāo)準(zhǔn)曲線方法測試與計算還原糖含量。

1.3.3 有機酸含量測定 采用RP-HPLC法[10]。流動相：0.01 mol/L KH2PO4-H3PO4緩沖溶液(pH 2.8)；流速：0.7 mL/min；柱溫：25 ℃；檢測波長：210 nm；樣品處理：樣品迅速離心(4 ℃，10 000 r/min，20 min)后上機分析，外標(biāo)法定量。

1.4 酒精發(fā)酵工藝

1.4.1 工藝流程

1.4.2 工藝要點 將運回實驗室的殘次紅棗參考拐棗預(yù)處理和酒精發(fā)酵的方法進行[10]。原料用水清洗，瀝干、稱重，按棗重加入1.5倍的飲用水，破碎打漿，漿液連同果渣一起轉(zhuǎn)入不銹鋼罐中，添加0.1%的活性干酵母混勻，常溫(約17 ℃)發(fā)酵，每12 h取樣，分析檢測發(fā)酵體系溫度、發(fā)酵液TSS、酒精度、還原糖含量以及pH值。

1.5 半自動連續(xù)醋酸發(fā)酵工藝

1.5.1 工藝流程

1.5.2 工藝要點 醋酸菌按10%的比例接種，維持發(fā)酵溫度34 ℃，以150 L/h通氣進行醋酸發(fā)酵。每12 h取樣分析發(fā)酵液酒精度和總酸度，當(dāng)酸度不再升高說明第一批醋酸發(fā)酵完成。后續(xù)棗酒液的醋化采用半自動連續(xù)醋酸發(fā)酵法：取出一半棗醋后補充等體積棗酒液繼續(xù)第二批次醋酸發(fā)酵(分割留種發(fā)酵)，每6 h取樣分析；第二批棗醋發(fā)酵完成后，再以相同方法完成下一批次，直到發(fā)酵生產(chǎn)完成[11]。發(fā)酵生產(chǎn)過程中，通過分析發(fā)酵周期、發(fā)酵液酸度變化，監(jiān)測判斷醋酸菌菌種的活力及傳代穩(wěn)定性。

1.6 統(tǒng)計分析

2 結(jié)果與分析

2.1 殘次鮮棗的營養(yǎng)與利用價值

在新鄭市孟莊鎮(zhèn)紅棗產(chǎn)區(qū)收集生長成熟開裂的鮮棗、落地棗和次等鮮棗，以優(yōu)質(zhì)鮮棗為對照，檢測其水分、VC、還原糖以及總可溶性固形物含量，結(jié)果見表1。

表1 殘次鮮棗與優(yōu)質(zhì)鮮棗主要營養(yǎng)成分對比?Table 1 Comparision of the main nutritional components between inferior jujube and high quality jujube

? 不同字母表示差異顯著(P<0.05)。

紅棗中的糖分含量豐富，是重要的營養(yǎng)和風(fēng)味成分[12]。鮮棗的含水量高，容易腐爛變質(zhì)，需要及時有效處理；落地棗的還原糖和VC含量顯著低于優(yōu)質(zhì)棗和開裂棗(P<0.05)，低等級鮮棗還原糖和VC含量低于優(yōu)質(zhì)棗，但差異不顯著(P>0.05)。由表1可知，次等鮮棗、開裂鮮棗與優(yōu)質(zhì)鮮棗相比在主要營養(yǎng)成分含量上并無明顯差異。殘次鮮棗原料營養(yǎng)豐富，尤其是含糖量較高，因此發(fā)酵生產(chǎn)棗醋不用外加碳源及其它營養(yǎng)物質(zhì)，開發(fā)純天然棗醋產(chǎn)品極具優(yōu)勢。

2.2 殘次鮮棗酒精發(fā)酵

殘次鮮棗經(jīng)前處理后接種果酒酵母進行常溫發(fā)酵，酒精發(fā)酵過程中發(fā)酵液品溫、TSS、酒精度、還原糖含量以及pH值變化見圖1。

同一條線上不同字母表示差異顯著 (P<0.05)圖1 酒精發(fā)酵過程動力學(xué)變化Figure 1 Time course of alcoholic fermentation for jujube vinegar (n=3)

在初始階段(0～12 h)，由于酵母菌的不斷活動，發(fā)酵體系溫度開始略有升高?？梢钥闯?，即使在相對較低的常溫條件下(紅棗成熟季節(jié))，棗漿的酒精發(fā)酵啟動很快；可能是紅棗原料營養(yǎng)全面、酸甜適宜，非常利于果酒酵母生長繁殖。在此條件下，酵母菌快速進行有氧增殖，發(fā)酵體系可以在較短的時間內(nèi)處于厭氧狀態(tài)，這樣有利于抑制有害雜菌的活動。酵母將紅棗原料中含有的蔗糖轉(zhuǎn)化為葡萄糖和果糖[13]，同時還可能因為果渣中部分可溶性糖逐漸溶出，發(fā)酵初期的還原糖含量未見減少反而顯著升高，同時發(fā)酵液TSS略有上升。另外，發(fā)酵體系中可以觀察到開始產(chǎn)生大量細膩的氣泡和酒帽。主發(fā)酵階段(12～60 h)，發(fā)酵液體系溫度顯著升高(最高為20.5 ℃)；總可溶性固形物顯著下降；酒精度顯著升高，酒度達到7.91%Vol。最后，發(fā)酵活動逐漸減弱，發(fā)酵液體系溫度恢復(fù)至室溫，最終酒精含量為8.07%Vol，酒精發(fā)酵結(jié)束。

2.3 棗醋醋酸發(fā)酵

傳統(tǒng)醋酸發(fā)酵周期往往在1個月以上，主要是醋酸發(fā)酵的啟動較困難，通常比循環(huán)醋化周期更長，分割留種發(fā)酵法可以顯著提高醋化效率[14-15]。本研究采用半自動連續(xù)醋酸發(fā)酵法，圖2是第一輪醋酸發(fā)酵過程中酒精度、總酸含量以及pH變化。

同一條線上不同字母表示差異顯著 (P<0.05)圖2 第一批醋酸發(fā)酵動力學(xué)變化Figure 2 Time course of the first cycle of acetic fermentation for jujube vinegar (n=3)

醋酸發(fā)酵初期(0～12 h)：經(jīng)過活化、擴大培養(yǎng)的醋酸菌不斷增殖，這一階段發(fā)酵液酒精度小幅下降、總酸度開始升高，說明菌種生長繁殖良好。醋化階段(12～60 h)：發(fā)酵液酒精度從7.29%Vol快速下降至0.6%Vol，總酸含量從0.79 g/100 mL 顯著升高至4.63 g/100 mL，pH也顯著下降至最低(3.37)；這是醋化產(chǎn)酸的主要階段。最后，棗醋總酸度達到4.88 g/100 mL。為了保證分割留種發(fā)酵中菌種活力，第一批發(fā)酵應(yīng)在60 h左右結(jié)束，補充紅棗酒液進行分割留種發(fā)酵。

采用分割留種發(fā)酵方式，進行了10個批次的醋酸發(fā)酵，發(fā)酵過程中酒精度和總酸含量變化見圖3，醋化過程明顯縮短。0～6 h為醋酸菌的增殖階段，為后期快速產(chǎn)酸做好準(zhǔn)備。分割留種發(fā)酵初期由于菌體濃度較高，增殖過程縮短。6～30 h為快速產(chǎn)酸階段，發(fā)酵液酒精被轉(zhuǎn)化，伴隨著總酸顯著升高(P<0.05)。醋酸發(fā)酵最后，為防止過度發(fā)酵應(yīng)及時補充紅棗酒液。

同一條線上不同字母表示差異顯著(P<0.05)圖3 分割留種醋酸發(fā)酵動力學(xué)變化Figure 3 Time course of the cycle of acetic fermentation for jujube vinegar (n=3)

為保證菌種良好的醋酸發(fā)酵活力，避免過度發(fā)酵，在后期的分割留種醋酸發(fā)酵中以30 h為發(fā)酵周期。可以看出，10個批次的分割留種醋酸發(fā)酵規(guī)律基本一致，各批次所得的棗醋總酸度為4.48～5.05 g/100 mL，總酸度基本相當(dāng)，平均值4.81 g/100 mL，變異系數(shù)0.15%。說明采用半自動連續(xù)醋酸發(fā)酵法可以穩(wěn)定、快速進行紅棗醋生產(chǎn)。

2.4 棗醋有機酸分析

采用RP-HPLC法分析鮮棗棗醋中的主要有機酸，標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖見圖4。

紅棗原料含有較為豐富的有機酸，有機酸是其重要的營養(yǎng)和風(fēng)味成分。馬倩倩等[16]采用HPLC法分析棗果中的有機酸，檢出了草酸、酒石酸、奎寧酸、蘋果酸、檸檬酸、富馬酸和抗壞血酸共7種有機酸，其中含量較高的為蘋果酸、檸檬酸和酒石酸。紅棗醋中共檢出10種有機酸見圖5，殘次鮮棗果醋和優(yōu)質(zhì)鮮棗果醋中各種有機酸含量見表2。紅棗醋醋酸含量最高，殘次棗果醋為4 399.52 mg/100 mL，優(yōu)質(zhì)棗果醋為4 467.06 mg/100 mL。其次是乳酸，殘次棗果醋為121.81 mg/100 mL，優(yōu)質(zhì)棗果醋為117.93 mg/100 mL。2個果醋樣品中含量較高的有機酸還有蘋果酸，殘次棗果醋蘋果酸含量為101.26 mg/100 mL，優(yōu)質(zhì)棗果醋為112.12 mg/100 mL；其它有機酸含量較低。

峰1.草酸 峰2.酒石酸 峰3.甲酸 峰4.蘋果酸 峰5.α-酮戊二酸 峰6.抗壞血酸 峰7.乳酸 峰8.醋酸 峰9.檸檬酸 峰10.富馬酸 峰11.琥珀酸

圖4 11種有機酸標(biāo)樣色譜圖
Figure 4 Chromatogram of eleven organic acids from a standard mixture

峰1.草酸 峰3.酒石酸 峰4.甲酸 峰6.蘋果酸 峰7.α-酮戊二酸 峰8.乳酸 峰10.醋酸 峰11.檸檬酸 峰12.富馬酸 峰13.琥珀酸

圖5 紅棗醋有機酸色譜圖
Figure 5 Chromatogram of ten organic acids from jujube vinegar

酒精發(fā)酵過程中常常伴有蘋果-乳酸發(fā)酵(MLF)或者蘋果酸-酒精發(fā)酵(MEF)[17-18]。在MLF中，乳酸菌能將蘋果酸轉(zhuǎn)化成乳酸和CO2[19]。鮮棗棗醋中含有較高的乳酸，說明殘次鮮棗在酒精發(fā)酵過程中存在有效的蘋果-乳酸發(fā)酵，增加了棗醋中非揮發(fā)酸含量，對棗醋柔和而豐富厚重的酸感有積極作用?？箟难崾枪吩现锌寡趸镔|(zhì)之一，在保藏以及打漿破碎、加熱等過程中通常不穩(wěn)定[20-21]。紅棗中含量較高的抗壞血酸在2個紅棗醋樣中均未檢出。盡管紅棗中VC含量豐富，原料經(jīng)過破碎、發(fā)酵等不同過程處理后還原型VC已逐漸氧化甚至降解消失。趙松等[22]以棗渣和大米為原料釀制棗醋，研究了不同發(fā)酵方法對棗醋有機酸的影響，共檢出醋酸、乳酸、蘋果酸、檸檬酸、琥珀酸等8種有機酸，主要有機酸組成和含量與本研究結(jié)果基本一致。

表2 紅棗醋有機酸含量Table 2 Contents of organic acids in the jujube vinegar mg/100 mL

3 結(jié)論

相比優(yōu)質(zhì)紅棗，殘次鮮棗的商品價值和利用程度低。但其營養(yǎng)成分可媲美優(yōu)質(zhì)鮮棗，是一種可發(fā)酵利用的農(nóng)業(yè)廢棄資源。殘次鮮棗加1.5倍水破碎打漿，直接接種0.1%的果酒干酵母于采收季節(jié)常溫發(fā)酵72 h可得酒度為8.07%Vol的紅棗酒液。棗酒液接種10%的活化醋酸菌菌種，經(jīng)過60 h可完成第一批醋酸發(fā)酵，棗醋酸度可達4.88 g/100 mL；進行10批次半自動連續(xù)醋酸發(fā)酵，發(fā)酵周期為30 h，制得紅棗醋平均酸度為4.81 g/100 mL；殘次鮮棗各批次醋酸發(fā)酵過程穩(wěn)定，最終產(chǎn)品酸度穩(wěn)定。

利用殘次鮮棗發(fā)酵生產(chǎn)的果醋中共檢出10種有機酸，主要為醋酸、乳酸和蘋果酸；其有機酸組成、含量與優(yōu)質(zhì)鮮棗果醋無明顯差異。以殘次鮮棗為原料通過半自動連續(xù)醋酸發(fā)酵法能高效生產(chǎn)紅棗醋，品質(zhì)與優(yōu)質(zhì)鮮棗果醋相當(dāng)，表明該方法可用于棗產(chǎn)區(qū)轉(zhuǎn)化殘次鮮棗資源生產(chǎn)鮮棗果醋。

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