外源轉(zhuǎn)基因片段從轉(zhuǎn)基因棉籽殼到食用菌水平轉(zhuǎn)移研究

白亞龍

索玉娟

林 婷

沈源源

趙曉燕

劉海燕

周昌艷

(上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所，上海 201403)

食用菌蛋白質(zhì)含量高，營(yíng)養(yǎng)豐富，具有增強(qiáng)免疫力、降血糖等保健作用[1]。棉籽殼營(yíng)養(yǎng)豐富是理想的食用菌栽培原料[2]。中國(guó)也是轉(zhuǎn)基因棉花種植大國(guó)，根據(jù)國(guó)際農(nóng)業(yè)生物技術(shù)應(yīng)用服務(wù)組織的報(bào)道，在2014年中國(guó)轉(zhuǎn)基因棉花種植面積就已達(dá)棉花總種植面積的93%，而且呈不斷增長(zhǎng)的趨勢(shì)[3]。大量的轉(zhuǎn)基因棉籽殼會(huì)作為培養(yǎng)料用于食用菌栽培，因此，有必要考察外源轉(zhuǎn)基因片段是否會(huì)通過(guò)栽培從轉(zhuǎn)基因棉籽殼水平轉(zhuǎn)移到所栽培的食用菌中。

在之前的研究中，并沒(méi)有達(dá)到統(tǒng)一的共識(shí)。徐寶梁[4]與于莉[5]分別用轉(zhuǎn)基因棉籽殼和轉(zhuǎn)基因油菜籽為主要原料種植平菇，均沒(méi)有發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因片段從棉籽殼向平菇水平轉(zhuǎn)移的現(xiàn)象，用添加有轉(zhuǎn)基因片段的液體培養(yǎng)基培養(yǎng)平菇菌絲體，也未發(fā)現(xiàn)水平轉(zhuǎn)移現(xiàn)象。然而，馬務(wù)超等[6]用轉(zhuǎn)基因棉籽種植銀耳，在所栽培的銀耳中檢出轉(zhuǎn)基因啟動(dòng)子CaMV35S與終止子NOS，但是沒(méi)有發(fā)現(xiàn)Cry1A片段。閆燕[7]與Ying Shang等[8]用轉(zhuǎn)基因棉籽種植平菇，采摘不同時(shí)期的平菇樣品，經(jīng)過(guò)PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)均存在外源轉(zhuǎn)基因片段CaMV35、NOS、CrylA(b)-CrylA(c)。總之，從目前的研究來(lái)看，對(duì)于轉(zhuǎn)基因棉籽殼栽培食用菌是否會(huì)發(fā)生外源轉(zhuǎn)基因片段水平轉(zhuǎn)移現(xiàn)象仍然需要更多的試驗(yàn)確認(rèn)與驗(yàn)證。本研究從銀耳生產(chǎn)基地與菇廠采集以棉籽殼為主要培養(yǎng)物栽培的15份銀耳樣品和10份平菇樣品，此外，還從大中型超市和農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)采集47份食用菌樣品，用PCR擴(kuò)增檢測(cè)是否存在轉(zhuǎn)基因棉籽殼中的外源片段CaMV35S、NOS、CpTⅠ、CryIA(c)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 試劑

溶壁酶：10 U/μL，上海天根生化科技有限公司；

蛋白酶K：40 mAnsom u/mg，美國(guó)Merck公司；

基因組DNA提取試劑盒：上海索來(lái)寶生物科技有限公司；

2×EasyTaq PCR SuperMix (-dye)-PCR SuperMix：北京全式金生物技術(shù)有限公司；

所用水均為滅菌的Milli-Q水。

1.1.2 食用菌樣品

15份轉(zhuǎn)基因棉籽殼為主原料栽培的銀耳樣品：培養(yǎng)基質(zhì)中棉籽殼含量>75%，采集自福建福州某銀耳種植基地；

10份以轉(zhuǎn)基因棉籽殼為主培養(yǎng)物栽培的平菇樣品：棉籽含量約為92%，采摘自上海奉賢莊行某菇廠；

47份市售食用菌樣品(其中平菇10份、杏鮑菇8份、香菇8份、金針菇6份、銀耳6份、海鮮菇4份、白玉菇3份、秀珍菇2份)：上海市閔行區(qū)各大中型超市與農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)。

1.1.3 引物

PCR擴(kuò)增所需引物見表1，均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.1.4 儀器

微量臺(tái)式離心機(jī)：Eppendorf 5415D型，德國(guó)Eppendorf公司；

恒溫混勻振蕩器：Thermo Mixer型，德國(guó)Eppendorf 公司；

PCR儀：Eppendorf AG型，德國(guó)Eppendorf公司。

1.2 方法

1.2.1 基因組DNA提取

(1) 平菇樣品等(除銀耳外的其他食用菌)基因組DNA提?。悍Q取少量(約1 g)樣品，倒入適量液氮，立即研磨，重復(fù)3次。取研成粉末的樣品100 mg，加200 μL試劑盒所配溶液A，加入10 μL溶壁酶與20 μL RNase A，再加入100 mg玻璃珠，在振蕩器上振蕩約5 min。加入40 μL 50 mg/mL的蛋白酶K，充分混勻，55 ℃孵育30 min。12 000 r/min 離心2 min。將上清轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的離心管中，加入200 μL試劑盒所配溶液B。接下來(lái)步驟完全參照試劑盒說(shuō)明書，最終基因組DNA溶解于100 μL緩沖液當(dāng)中。

(2) 銀耳樣品基因組DNA提?。悍Q取少量(約1 g)樣品，倒入適量的液氮，立即研磨，重復(fù)3次。取研成粉末的樣品50 mg，加400 μL試劑盒所配溶液A，加入10 μL溶壁酶與20 μL RNase A，再加入100 mg玻璃珠，在振蕩器上振蕩約5 min。加入40 μL 50 mg/mL的蛋白酶K，充分混勻，55 ℃ 孵育30 min。加入與溶液等量的10% CTAB溶液，65 ℃ 繼續(xù)處理30 min，12 000 r/min離心5 min。取200 μL上清轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的離心管中，然后加入200 μL試劑盒所配溶液B。后續(xù)步驟同1.2.1(1)。

表1 引物序列匯總Table 1 The sequences of primers for PCR

1.2.2 PCR檢測(cè)

(1) PCR擴(kuò)增體系(25 μL)：12.5 μL 2×EasyTaq PCR SuperMix (-dye)-PCR SuperMix，10 μmmol/L的上下游引物各0.5 μL，加無(wú)菌水至25 μL。

(2) PCR熱循環(huán)步驟：94 ℃保持5 min，每個(gè)循環(huán)溫度為94，58，72 ℃下分別保持30 s，共35個(gè)循環(huán)，最后72 ℃再延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用2%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，4S Red Plus核酸染色劑(上海生工)染色觀察結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 以保守基因擴(kuò)增結(jié)果評(píng)價(jià)銀耳與平菇所提取基因組DNA

在食用菌樣品的基因組DNA提取中，為了增加DNA提取的效率，參照說(shuō)明書之外，對(duì)有些步驟進(jìn)行了適當(dāng)?shù)恼{(diào)整。在提取中，因?yàn)殂y耳含有大量的膠質(zhì)，在液氮研磨之后用溶液溶解，即使離心也是呈現(xiàn)黏稠的流體狀，無(wú)法用試劑盒所配的層析柱進(jìn)行操作。參考文獻(xiàn)[9]在處理液中添加10%的CTAB溶液(使終濃度為5%)處理，離心后得到澄清的上層清液。以來(lái)自于銀耳種植基地和菇廠的15份銀耳和10份平菇樣品為例，提取的基因組DNA母液在稀釋10倍后，進(jìn)行內(nèi)源基因的擴(kuò)增。平菇樣品擴(kuò)增平菇β-action基因(引物為AC-r/f)[10-11]，銀耳樣品用真菌通用引物ITS4/5進(jìn)行擴(kuò)增。電泳結(jié)果均呈現(xiàn)明亮的條帶(圖1)，說(shuō)明提取的DNA無(wú)抑制物，可以進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測(cè)。

M.DNA Marker NC.陰性對(duì)照?qǐng)D1 15份銀耳樣品與10份平菇樣品的內(nèi)源基因擴(kuò)增Figure 1 Amplification of endogenous genes of 15 Tremella fuciformis samples and 10 Pleurotus ostreatus samples

2.2 確定栽培銀耳與平菇所用轉(zhuǎn)基因棉籽殼中轉(zhuǎn)基因片段

轉(zhuǎn)基因序列擴(kuò)增所需引物參照SN/T 1199—2010，選取CaMV35S啟動(dòng)子、NOS終止子、結(jié)構(gòu)基因CpTⅠ、CryIA(b)+CryIA(c)、CryIA(c)進(jìn)行檢測(cè)，以上海市某菇廠的棉籽殼為例(圖2)，檢出CaMV35S啟動(dòng)子、NOS終止子、結(jié)構(gòu)基因CpTⅠ、CryIA(c)，同樣地，在來(lái)自于福建銀耳種植基地的棉籽殼中同樣也擴(kuò)增出了這些基因(對(duì)培養(yǎng)料進(jìn)行檢測(cè)，也檢測(cè)到這4個(gè)基因)。說(shuō)明這2種棉籽殼來(lái)源于品種相同的棉花。不同品種的轉(zhuǎn)基因棉花所檢測(cè)到的序列并不相同，在另一家上海菇廠提供的棉籽殼中，檢測(cè)到CaMV35S啟動(dòng)子、NOS終止子、結(jié)構(gòu)基因CryIA(b)+CryIA(c)、CryIA(c)，而未擴(kuò)增出CpTⅠ序列。在銀耳養(yǎng)殖基地的15份銀耳樣品與菇廠的10份平菇樣品中只篩查檢出CaMV35S、NOS、CpTⅠ、CryIA(c) 4種轉(zhuǎn)基因片段。

M.DNA Marker 1.CaMV35S-r/f 2.CpTⅠ-r/f 3.CryIA(b)+CryIA(c)-r/f 4.CryIA(c)-r/f 5.NOS-r/f 6.C18srDNA-r/f NC.陰性對(duì)照

圖2 棉籽殼中轉(zhuǎn)基因序列PCR擴(kuò)增后電泳圖
Figure 2 Amplification of foreign sequences from genetically modified cottonseed hulls

2.3 轉(zhuǎn)基因棉籽殼栽培的銀耳與平菇樣品中轉(zhuǎn)基因片段的檢測(cè)

15份新鮮銀耳樣品連同棉籽棒一同收集，提取DNA前銀耳均生長(zhǎng)于棉籽棒上，狀態(tài)良好。最終PCR結(jié)果見圖3，CaMV35S啟動(dòng)子、NOS終止子、結(jié)構(gòu)基因CpTⅠ、CryIA(c)均沒(méi)有檢測(cè)到，說(shuō)明無(wú)論啟動(dòng)子與終止子還是結(jié)構(gòu)基因均沒(méi)有發(fā)現(xiàn)從轉(zhuǎn)基因棉籽殼向銀耳發(fā)生水平轉(zhuǎn)移的現(xiàn)象。

M.DNA Marker NC.陰性對(duì)照 PC.陽(yáng)性對(duì)照?qǐng)D3 15份銀耳樣品外源性轉(zhuǎn)基因片段擴(kuò)增Figure 3 The amplification of foreign genes in 15 Tremella fuciformis samples

對(duì)10份采自菇廠的帶有菌菇棒的平菇樣品做了相同的PCR擴(kuò)增檢測(cè)(提取DNA之前平菇均生長(zhǎng)于含有轉(zhuǎn)基因棉籽殼培養(yǎng)基質(zhì)上，生長(zhǎng)狀態(tài)良好)，PCR結(jié)果顯示并無(wú)目標(biāo)轉(zhuǎn)基因片段被擴(kuò)增(圖4)，說(shuō)明在平菇樣品內(nèi)并不存在轉(zhuǎn)基因片段。雖然有些引物擴(kuò)增會(huì)出現(xiàn)一些非特異性產(chǎn)物，但是在目標(biāo)條帶大小處并沒(méi)有出現(xiàn)相應(yīng)擴(kuò)增條帶。

2.4 市售食用菌樣品中外源轉(zhuǎn)基因片段檢測(cè)

在銀耳種植基地和菇廠采集的以轉(zhuǎn)基因棉籽殼為主要培養(yǎng)料的銀耳和平菇樣品中，沒(méi)有檢測(cè)到外源轉(zhuǎn)基因片段。除此之外，還從當(dāng)?shù)氐霓r(nóng)貿(mào)市場(chǎng)與超市采集食用菌樣品47份，其中，平菇樣品10份、香菇樣品8份、杏鮑菇8份、銀耳樣品6份、蟹味菇樣品4份、秀珍菇樣品2份。這些樣品是市面上常見的食用菌，而且可能會(huì)被含有棉籽殼的培養(yǎng)基質(zhì)栽培。有些食用菌雖然市場(chǎng)常見，但不會(huì)用棉籽殼培養(yǎng)，所以未被采集，如屬于草腐菌的雙孢蘑菇。最終的PCR檢測(cè)結(jié)果(見表2)顯示，47份購(gòu)買自大中型超市與農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)的樣品均沒(méi)有檢測(cè)到外源轉(zhuǎn)基因片段。

表2 市售食用菌樣品外源轉(zhuǎn)基因片段PCR檢測(cè)結(jié)果?Table 2 The amplification of foreign genes in edible fungi purchased from markets

? +表示陽(yáng)性；-表示陰性；表示未檢測(cè)。

M.DNA maker NC.陰性對(duì)照 PC.陽(yáng)性對(duì)照?qǐng)D4 10份平菇樣品外源性轉(zhuǎn)基因片段篩查Figure 4 The amplification of foreign genes in 10 Pleurotus ostreatus samples

與之前的一些研究不同，不論是種植基地用轉(zhuǎn)基因棉籽殼為主要原料栽培的銀耳和平菇，還是采集市售的樣品，均沒(méi)有檢測(cè)到轉(zhuǎn)基因棉籽殼中的外源片段。閆燕等[7]與Ying Shang等[8]用轉(zhuǎn)基因棉籽種植平菇，在栽培的不同時(shí)期采樣檢測(cè)，均檢測(cè)到外源轉(zhuǎn)基因片段。然而，同時(shí)也在平菇中檢測(cè)到棉籽的內(nèi)源基因Sad。出現(xiàn)這種情況，可能性有二：① 基因片段可以通過(guò)水分進(jìn)入平菇菌體內(nèi)，也就是說(shuō)不論是轉(zhuǎn)基因還是非轉(zhuǎn)基因片段，只要是培養(yǎng)基質(zhì)中含有的基因片段均可能出現(xiàn)在平菇菌體內(nèi)，從而被檢測(cè)到。如果這樣，與轉(zhuǎn)基因與否并不相關(guān);② 可能是提取的平菇基因組DNA遭到棉籽殼基因組DNA的污染，所以，不論是棉籽殼中含有的轉(zhuǎn)基因片段還是內(nèi)源基因均被檢測(cè)到。PCR易于污染，尤其是檢測(cè)樣品與陽(yáng)性樣品在液氮研磨、提取DNA、PCR等操作步驟一同進(jìn)行的情況下。針對(duì)前一種可能，徐寶梁[4]與于莉[5]用額外添加轉(zhuǎn)基因序列的液體培養(yǎng)液培養(yǎng)平菇菌絲體進(jìn)行檢測(cè)，未在菌絲體中發(fā)現(xiàn)外源轉(zhuǎn)基因片段，也就是說(shuō)基因片段并不能通過(guò)水分進(jìn)入菌體。當(dāng)然，即使這種情況存在，也僅僅是外源轉(zhuǎn)基因片段通過(guò)水分進(jìn)入食用菌菌體，其實(shí)質(zhì)類似于食用菌菌體沾染了微量的棉籽殼核酸物質(zhì)，并不會(huì)引起食品安全方面的憂慮。

3 結(jié)論

本研究考察了轉(zhuǎn)基因棉籽殼的外源轉(zhuǎn)基因片段是否會(huì)通過(guò)栽培水平轉(zhuǎn)移到食用菌中。從銀耳生產(chǎn)基地和菇廠采集用轉(zhuǎn)基因棉籽殼栽培的15份銀耳樣品與10份平菇樣品，PCR擴(kuò)增檢測(cè)是否存在轉(zhuǎn)基因棉籽殼中的外源片段CaMV35S、NOS、CpTⅠ、CryIA(c)，結(jié)果均沒(méi)有發(fā)現(xiàn)目標(biāo)序列被擴(kuò)增。針對(duì)可能會(huì)用含有棉籽殼基質(zhì)培養(yǎng)的市售食用菌，從大中型超市與農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)采集47份樣品，通過(guò)PCR擴(kuò)增檢測(cè)轉(zhuǎn)基因棉籽殼中的外源片段CaMV35S、NOS、CpTⅠ、CryIA(b)+CryIA(c)、CryIA(c)，結(jié)果也沒(méi)有發(fā)現(xiàn)目標(biāo)序列被擴(kuò)增。總之，通過(guò)PCR篩查，未發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因棉籽殼中外源轉(zhuǎn)基因片段有向所栽培食用菌水平轉(zhuǎn)移的現(xiàn)象。

本研究未發(fā)現(xiàn)外源轉(zhuǎn)基因片段會(huì)從轉(zhuǎn)基因培養(yǎng)料進(jìn)入食用菌內(nèi)，為轉(zhuǎn)基因培養(yǎng)物栽培食用菌的安全性進(jìn)行了澄清。當(dāng)然，這僅僅是定點(diǎn)考察與市場(chǎng)初步篩查的結(jié)果，想要得到更多確切的結(jié)果，可以考慮在食用菌生長(zhǎng)周期澆灌含有人為添加特定外源序列的水，確定外源片段是否會(huì)隨水分進(jìn)入食用菌菌體內(nèi)，還可以考察培養(yǎng)基物質(zhì)所含DNA片段是否有可能通過(guò)水分進(jìn)入食用菌菌體內(nèi)。此外，還可以考慮進(jìn)一步加大市售食用菌樣品篩查樣本量，用更大量的數(shù)據(jù)徹底消除生產(chǎn)者與消費(fèi)者的顧慮。

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