瑞舒伐他汀對急性心肌梗死大鼠心肌細胞保護作用及RhoA/ROCK活化機制

葛水秀

急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)是指冠狀動脈急性以及持續(xù)性缺血，使得心肌出現(xiàn)缺氧進而導(dǎo)致心肌壞死的一類疾病[1]。而瑞舒伐他汀則是目前臨床上一種新型他汀類藥物，有相關(guān)資料報道其對于心肌梗死后細胞凋亡、心功能損害以及心室肌細胞重塑等都具有較好地改善作用，但是由于其作用機制至今仍然尚未明確[2]。為了探討瑞舒伐他汀對急性心肌梗死大鼠心肌細胞保護作用及RhoA/ROCK活化機制，我們利用SD大鼠進行了相關(guān)實驗研究，研究結(jié)果現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料：凝膠成像系統(tǒng)(北京東勝創(chuàng)新生物科技有限公司)；蛋白定量試劑盒、蛋白提取試劑盒和HRP標記羊抗兔IgG(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；兔抗大鼠B淋巴細胞瘤-基因(B_cell lymphoma，Bcl_2)、BCL2_Associated X的蛋白質(zhì)(BCL2_Associated X，Bax)、ROCK1、ROCK2、NF_κB與其抑制蛋白(Inhibitor κB，I_κB)、NF_κBp65抗體(沈陽萬類生物科技有限公司)；大鼠C反應(yīng)蛋白(C reactive protein，CRP)、腫瘤壞死因子_α(tumor necrosis factor_α，TNF_α)、白細胞介素_6(interleukin_6，IL_6)ELISA試劑盒(武漢Uscn)；ECL發(fā)光試劑盒(北京康為試劑生物技術(shù)有限公司)。

1.2 方法：

1.2.1 動物分組：選取40只生理狀況相近、體質(zhì)量約為250g的成年健康SD大鼠，不限雌雄；按照隨機數(shù)字表法將入選大鼠隨機分為瑞舒伐他汀組、AMI組、假手術(shù)組、正常組四組，每組10只。

1.2.2 手術(shù)及處理方法：各組大鼠均給予40mg/kg的戊巴比妥鈉進行腹腔注射麻醉，隨后進行口腔氣管插管并連接小動物呼吸機。除正常組外各組大鼠均胸部去毛，從胸骨左側(cè)縱向切口打開胸腔并充分暴露心臟，統(tǒng)一使用7號絲線穿過大鼠的左冠狀動脈前降支進行結(jié)扎，清除腔內(nèi)淤血后排除氣體并逐層關(guān)閉胸腔并縫合傷口。其中假手術(shù)組大鼠開胸后只進行穿線而不結(jié)扎，正常組大鼠則常規(guī)飼養(yǎng)而不進行任何處理。在術(shù)后24小時后對瑞舒伐他汀組大鼠給予1.0/kg·d的劑量瑞舒伐他汀溶液進行灌胃處理，而AMI組大鼠則使用等體積量的蒸餾水進行同樣灌胃，另外兩組大鼠進行常規(guī)飼養(yǎng)。術(shù)后24小時候開始每天進行一次給藥，持續(xù)4個星期并于4個星期后進行取材，其中每組5只大鼠的心臟制成石蠟切片并用TUNEL法測定心肌細胞凋亡情況，另外5只大鼠使用TTC/伊文思藍染色測定心肌相對的梗死面積[3]。

1.2.3 測定指標：使用試劑盒法對各組大鼠肌酸激酶(CK)和氧化損傷標記分子丙二醛(malondialdehyde，MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)以及心肌損傷標記分子乳酸鹽脫氫酶(LDH)的表達水平進行檢測，使用ELISA法對IL_6、TNF_α、炎性因子CRP等水平進行檢測，使用TTC/伊文思藍染色測定大鼠的心肌相應(yīng)梗死面積，利用HE染色對大鼠心臟組織病理變化進行檢測，使用TUNEL法檢測大鼠心肌細胞凋亡情況，使用Western印跡法檢測大鼠體內(nèi)NF_κBp65、ROCK1、ROCK2、Bcl_2、Bax等表達水平[4]。

2 結(jié)果

2.1 瑞舒伐他汀對缺血引起SD大鼠心肌組織的保護作用：經(jīng)缺血處理后瑞舒伐他汀組SD大鼠心肌梗死情況得到較好地緩解，其梗死面積下降至(30.00±7.00)%，顯著低于AMI組大鼠心肌梗死面積(43.00±5.00)%(P<0.05)；并且瑞舒伐他汀組大鼠血清中心肌損傷標記分子LDH和CK水平均顯著低于AMI組大鼠，其中瑞舒伐他汀組大鼠LDH和CK水平分別為(1572.13±362.14)U/L和(4.39±1.25)U/ml，而AMI組大鼠的LDH和CK水平分別為(2459.42±683.45)U/L和(7.51±1.69)U/ml，兩組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)。此外假手術(shù)組大鼠的心肌細胞無炎性細胞浸潤而排列整齊，相較而言AMI組大鼠梗死區(qū)則有較多炎性細胞浸潤、心肌纖維排列紊亂且心肌細胞數(shù)量較少，而瑞舒伐他汀組心肌細胞炎性程度低且心肌細胞排列較為整齊。由此提示經(jīng)瑞舒伐他汀治療后AMI組大鼠的心肌組織炎癥程度有所降低，圖1。

2.2 瑞舒伐他汀對缺血引起的大鼠心肌組織抗氧化作用：AMI組大鼠心肌組織和血清中的抗氧化分子SOD水平較假手術(shù)組大鼠急劇下降，同時AMI組大鼠氧化損傷標致分子MDA水平則顯著高于假手術(shù)組大鼠(均P<0.01)；而瑞舒伐他汀組大鼠SOD水平則與AMI組大鼠無統(tǒng)計學(xué)意義，其MDA水平則顯著低于AMI組水平(P<0.05)，由此提示瑞舒伐他汀能夠在心肌細胞的保護中起到抗氧化的作用效果，見表1。

表1 比較四組大鼠氧化應(yīng)激分子的表達水平

注：與假手術(shù)組比較*P<0.01；與AMI組比較#P<0.05

2.3 瑞舒伐他汀對缺血導(dǎo)致大鼠的心肌組織抗炎作用：AMI組大鼠血清中的IL_6、TNF_α、CRP等水平均顯著高于假手術(shù)組大鼠(均P<0.01)；而瑞舒伐他汀組大鼠的IL_6、TNF_α、CRP等水平則顯著低于AMI組大鼠(均P<0.05)，同時又稍高于假手術(shù)組大鼠但無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表2。

表2 比較四組大鼠炎癥因子的表達水平

注：與假手術(shù)組比較*P<0.01；與AMI組比較#P<0.05

2.4 瑞舒伐他汀抑制缺血導(dǎo)致大鼠的心肌組織Rho激酶信號：AMI組大鼠的ROCK1和ROCK2的表達水平分別為(1.07±0.06)和(1.49±0.04)均顯著高于假手術(shù)組大鼠的(0.41±0.04)和(0.53±0.03)，兩組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)；而瑞舒伐他汀組大鼠的ROCK1和ROCK2的表達水平則分別為(0.64±0.03)和(0.67±0.03)，顯著低于AMI組大鼠(均P<0.05)，由此提示Rho激酶可能為瑞舒伐他汀的作用靶點。

3 討論

急性心肌梗死多具有劇烈而持久的胸骨后疼痛癥狀，并且在休息及服用硝酸酯類藥物后亦不能完全緩解，常并發(fā)有休克、心律失?；蛐牧λソ叩劝Y狀危及患者生命[5]。臨床上該類患者多是由冠狀動脈粥樣硬化狹窄的基礎(chǔ)上出現(xiàn)的急性心肌缺血壞死，但是如果患者冠狀動脈痙攣或者心肌耗氧量劇增也可以引發(fā)AMI的出現(xiàn)，其常見病因包括過勞、過于激動緊張、暴飲暴食、過度寒冷刺激、便秘以及吸煙和大量飲酒等[6]。其臨床表現(xiàn)少數(shù)患者無疼痛感出現(xiàn)，一開始即出現(xiàn)急性心力衰竭或著休克；而多數(shù)患者則有出汗和煩躁不安，表現(xiàn)為突然發(fā)作持久而劇烈的心前區(qū)或胸骨后壓榨性疼痛；部分患者則有上腹部疼痛出現(xiàn)，因此常被誤診為胃穿孔等急腹癥；此外急性心肌梗死患者還通常會有神志障礙、難以形容的不適等全身癥狀、惡心嘔吐等胃腸道癥狀，起病1至2周內(nèi)原有心絞痛癥狀的患者心絞痛加重，原無心絞痛癥狀患者則突然出現(xiàn)長時間心絞痛[7，8]。急性心肌梗死患者臨床常見有心臟破裂、心肌梗死早期或梗死灶已纖維化的愈合期出現(xiàn)室壁瘤、形成附壁血栓、心率衰竭、心源性休克或心肌梗死后綜合征等并發(fā)癥[9，10]。臨床治療AMI主要以挽救瀕死心肌、縮小梗死面積和保護心臟功能以及及時處理各種并發(fā)癥為治療原則，通常為鎮(zhèn)靜止痛、抗心律失常、調(diào)整血容量、再灌注縮小梗死面積、直接冠狀動脈介入以及溶栓治療等配合監(jiān)護和一般治療[11，12]。由于AMI死亡率高，預(yù)后多為不良，所以醫(yī)學(xué)界內(nèi)對于AMI的治療探索也投入了更多的人力和物力[13，14]。

本文結(jié)果顯示，瑞舒伐他汀組大鼠梗死面積下降，顯著低于AMI組大鼠心肌梗死面積；且瑞舒伐他汀組大鼠血清中心肌損傷標記分子LDH和CK水平均顯著低于AMI組大鼠，兩組比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。假手術(shù)組大鼠的心肌細胞無炎性細胞浸潤而排列整齊，相比而言AMI組大鼠梗死區(qū)則有較多炎性細胞浸潤、心肌纖維排列紊亂且心肌細胞數(shù)量較少，而瑞舒伐他汀組心肌細胞炎性程度低且心肌細胞排列較為整齊。由此提示經(jīng)瑞舒伐他汀治療后AMI組大鼠的心肌組織炎癥程度有所降低[15]。AMI組大鼠心肌組織和血清中的抗氧化分子SOD水平較假手術(shù)組大鼠急劇下降，同時AMI組大鼠氧化損傷標致分子MDA水平則顯著高于假手術(shù)組大鼠；而瑞舒伐他汀組大鼠SOD水平則與AMI組大鼠無統(tǒng)計學(xué)意義，其MDA水平則顯著低于AMI組水平，由此提示瑞舒伐他汀能夠在心肌細胞的保護中起到抗氧化的作用效果。AMI組大鼠血清中的IL_6、TNF_α、CRP等水平均顯著高于假手術(shù)組大鼠；而瑞舒伐他汀組大鼠的IL_6、TNF_α、CRP等水平則顯著低于AMI組大鼠，同時又稍高于假手術(shù)組大鼠但無統(tǒng)計學(xué)意義。AMI組大鼠的ROCK1和ROCK2的表達水平均顯著高于假手術(shù)組大鼠的比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義；而瑞舒伐他汀組大鼠的ROCK1和ROCK2的表達水平則顯著低于AMI組大鼠，由此提示了Rho激酶可能為瑞舒伐他汀的作用靶點。

瑞舒伐他汀是臨床上較為常見的一種選擇性HMG_CoA還原酶抑制劑，其中HMG_CoA還原酶抑制劑則主要是將3_羥基_3_甲基戊二酰輔酶A轉(zhuǎn)變?yōu)榧孜焖猁}一膽固醇的前體一的限速酶。瑞舒伐他汀臨床主要作用于肝-降低膽固醇的靶向器官，其增加了肝LDL細胞的表面受體數(shù)量，促進LDL的吸收與分解代謝，并且抑制VLDL的肝合成進而降低LDL和VLDL的微?？倲?shù)。臨床上瑞舒伐他汀主要用于高膽固醇血癥和高脂血癥患者，同時也適用于無心臟病臨床表現(xiàn)但是又存在心臟疾病風險的患者，能夠起到減少心肌梗死和腦卒中以及再造冠狀動脈血管的風險。

綜上所述，對于大鼠急性缺血導(dǎo)致心肌細胞凋亡現(xiàn)象瑞舒伐他汀能夠起到較好地緩解效果，其可能的作用機制為對RhoA/ROCK活化和介導(dǎo)的炎癥及氧化應(yīng)激反應(yīng)進行有效的抑制。

[1]宋占春,白靜慧,汪琦,等.瑞舒伐他汀對急性心肌梗死大鼠心肌細胞凋亡的拮抗作用及可能機制[J].中華醫(yī)學(xué)雜志,2015,95(45):3695-3700.

[2]Jin QH, Chen YD, Tian F, et al. Vessel healings after stenting with different polymers in STEMI patients[J]. J Geriatr Cardiol,2016,13(4):306-311.

[3]張?zhí)m芳,齊曉勇,賈新未,等.不同劑量瑞舒伐他汀對急性心肌梗死經(jīng)皮冠狀動脈介入治療患者心肌再灌注及心功能的影響[J].中國臨床藥理學(xué)雜志,2015,31(13):1223-1226.

[4]吳萃榮,王湛.瑞舒伐他汀與阿托伐他汀對急性心肌梗死患者PCI術(shù)后左室重構(gòu)及近期預(yù)后影響的比較[J].實用醫(yī)學(xué)雜志,2015,31(3):470-472.

[5]Feiz F, Sedghi R, Salehi A, et al. Study of the efficacy, safety and tolerability of low_molecular_weight heparin vs. unfractionated heparin as bridging therapy in patients with embolic stroke due to atrial fibrillation[J]. J Vasc Interv Neurol,2016,9(1):35-41.

[6]劉科衛(wèi),李曉燕,張國明,等.不同劑量瑞舒伐他汀對急性心肌梗死擇期介入治療患者近中期預(yù)后的影響[J].第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報,2013,35(6):576-579.

[7]郭素萍,張霞,高傳玉,等.大劑量瑞舒伐他汀對急性心肌梗死患者血清高敏 C反應(yīng)蛋白、MMP_9及心功能的影響[J].鄭州大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版),2013,48(6):836-838.

[8]Wenger NK, Ma CS. Geriatric cardiology and the Great Wall International Congress of Cardiology 2015[J]. J Geriatr Cardiol,2016,13(4):279-281.

[9]張北玉,劉燦君,孫爽,等.瑞舒伐他汀早期干預(yù)治療對急性心肌梗死患者行急診經(jīng)皮冠狀動脈介入治療中冠狀動脈血流的影響[J].中國循環(huán)雜志,2013,28(4):270-273.

[10]張玲,張蕾,李霞,等.瑞舒伐他汀對急性心肌梗死大鼠心肌重構(gòu)的影響[J].中國老年學(xué)雜志,2015,35(19):5389-5391.

[11]吳忠林,湯建民.瑞舒伐他汀對急性心肌梗死大鼠心肌細胞凋亡的影響[J].實用醫(yī)學(xué)雜志,2012,28(17):2852-2854.

[12]Li DD, Wang XY, Xi SZ, et al. Relationship between ADP_induced platelet_fibrin clot strength and anti_platelet responsiveness in ticagrelor treated ACS patients[J]. J Geriatr Cardiol, 2016,13(4):282-289.

[13]孫濤,萬大國,宋恒良,等.瑞舒伐他汀對大鼠急性心肌梗死后梗死組織miR_126的表達及血管再生的影響[J].鄭州大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版),2013,48(5):640-642,643.

[14]馮惠平,馮惠清,王占啟,等.瑞舒伐他汀對急性心肌梗死患者血清IL_6、GMP_140、BNP水平及心功能的影響[J].山東醫(yī)藥,2014,54(11):38-39.

[15]王旭剛,高政.瑞舒伐他汀預(yù)處理對大鼠腦缺血再灌注損傷模型NF_κB表達的影響[J].心腦血管病防治,2016,16(1):11-12.