基于紫外分光光度法的土壤過氧化氫酶活性的測量

師玉強(qiáng)

【摘 要】土壤酶作為土壤中的重要成分，對其的研究能夠較為準(zhǔn)確的反映土壤生物活性，過氧化氫酶是其中非常重要的一種酶類，對其活性的測量有著重要意義。為了得到一種方便、可靠的測定方法，本文就基于紫外分光光度法的土壤過氧化氫酶活性的測量展開研究。結(jié)果表明，紫外分光光度法具有較好的重現(xiàn)性、穩(wěn)定性，且操作簡單，值得推廣應(yīng)用。

【關(guān)鍵詞】紫外分光光度法；土壤；過氧化氫酶；活性

土壤酶活性可以有效地反映土壤生化反應(yīng)強(qiáng)度，以及土壤肥力水平，而且土壤中的各種生化反應(yīng)與養(yǎng)分轉(zhuǎn)換大多都離不開土壤酶的參與。就其來源來說，土壤酶主要源自于各類微生物的活動以及植物的生長，對土壤的耕作、周邊環(huán)境的改變都會在一定程度上影響其活性。過氧化氫酶，是其中非常重要的一種酶類，與生物的新陳代謝、生物分解密切相關(guān)，而在生物體中，其可以起到破壞過氧化氫的作用。因此，對過氧化氫酶的研究有著重要的應(yīng)用價(jià)值，一直以來，眾多學(xué)者都在努力探索一種簡單、方便、準(zhǔn)確的測量其活性的方法。本文就基于紫外分光光度法的土壤過氧化氫酶活性的測量進(jìn)行研究，希望為相關(guān)領(lǐng)域的研究提供一定參考。

一、材料與方法

（一）材料

試驗(yàn)材料包括以下幾種：紅壤1、紅壤2、山地黃壤和山地暗黃棕壤。材料取回后需挑出植物根系、碎石等雜物，等待自然風(fēng)干后過1mm篩備用。

（二）方法

1.紫外分光光度法

過氧化氫酶的作用，可使過氧化氫分解為水和氧氣。在樣品中加入定量的過氧化氫，經(jīng)過一段時間后，計(jì)算加入與剩余量之差即為與酶發(fā)生反應(yīng)分解的過氧化氫，用以表示酶活性。過氧化氫（H2O2）在240nm處有強(qiáng)烈吸收，通過測定樣品在此狀態(tài)下的吸光度，就可得到過氧化氫的濃度。

稱取樣品2.00 g，添加40 ml蒸餾水，加入5 ml H2O2溶液，經(jīng)過震蕩20分鐘。迅速添加鋁鉀礬1 ml，過濾于5 ml 1.5 mol L-1的硫酸溶液中。經(jīng)濾干處理，將濾液在240 nm處測定吸光度As。同時做無土A0和無基質(zhì)Ak對照。

2.高錳酸鉀滴定法

稱取樣品2.00 g，添加40ml蒸餾水，加入5 ml 的H2O2溶液，經(jīng)過振蕩20分鐘后加入1ml鋁鉀礬，過濾于盛有5 ml 1.5 M硫酸中，經(jīng)濾干處理，吸取濾液25 ml，用高錳酸鉀溶液滴定至紫色，同時做無土對照。

二、結(jié)果分析

（一）方法的重現(xiàn)性

稱取20份紅壤1樣品，各2.00g，10份用于加基質(zhì)的反應(yīng)，另外10份用于無基質(zhì)對照，同時做一份無土對照。根據(jù)測定方法處理溶液的吸光度后，取樣25ml用高錳酸鉀溶液處理，分別比較兩種方法下的酶活性。

研究表明，兩種方法測得的平均值極為接近，用t檢驗(yàn)，兩種方法得到的結(jié)果之間無明顯差別（P=0.663）。在重現(xiàn)性上來看，高錳酸鉀法的標(biāo)準(zhǔn)差、變異系數(shù)均高于紫外分光光度法。這表明后者的重現(xiàn)性要好于前者。

（二）穩(wěn)定性

稱取10份紅壤1樣品，各2.00g，5份加入過氧化氫，另外5份不加用于對照。嚴(yán)格按照順序測算吸光度，之后分別放置2、3、4、11小時后進(jìn)行測定。結(jié)果表明，時間對吸光度的影響不大，無論是哪一組，都無明顯差別，這就表明在酸性環(huán)境下，過氧化氫非常穩(wěn)定，吸光度無明顯改變。

（三）硫酸加入方法的影響

稱取20份紅壤2樣品，各2.00g，分別采取以下四種處理方法：第一種，加H2O2振蕩后加酸迅速過濾；第二種，加H2O2振蕩后直接過濾到盛有酸液的容器中；第三種，無基質(zhì)對照加酸后過濾；第四種，無基質(zhì)對照直接過濾到盛有酸液的容器中；每種重復(fù)5次。結(jié)果表明，不同的加入順序?qū)ξ舛扔泻艽笥绊憽５谝环N方法，吸光度已超過了儀表的讀數(shù)范圍，難以測得數(shù)值；第三種方法，吸光度也超過了1，這已是無法測得酶的活性，該種方法下的溶液有顏色，就算是用容量法也對終點(diǎn)判定有很大影響，在有機(jī)質(zhì)含量較高的條件下已無法滴定；第二種與第四種方法，其吸光度均在相應(yīng)范圍內(nèi)，由此得到的酶活性之間無明顯差別。

（四）鋁鉀礬的影響

稱取30份紅壤2樣品，各2.00g，分別采取以下六種處理方法：加H2O2與不加H2O2的無基質(zhì)對照。按振蕩前加、振蕩后加1ml鋁鉀礬和不加鋁鉀礬，各重復(fù)5次。結(jié)果表明，是否加入鋁鉀礬、采用何種方式加入都會對吸光度產(chǎn)生影響。不加鋁鉀礬時，過濾速度非常慢，溶液比較渾濁，因此不加鋁鉀礬的吸光度要高。加入順序?qū)τ谢|(zhì)樣品的吸光度有很大影響，振蕩前大于振蕩后的吸光度。加入順序?qū)o基質(zhì)對照的吸光度無影響，各組吸光度無明顯差別。

（五）不同土壤上的運(yùn)用

取不同的土壤樣品分別進(jìn)行過氧化氫酶活性的測量，各重復(fù)5次。結(jié)果表明，不同土壤的過氧化氫酶活性的測量結(jié)果之間無明顯差別，這證明了紫外分光光度法可應(yīng)用于過氧化氫酶活性的測量。

三、討論

對于土壤過氧化氫酶的測量有多種方法：（1）高錳酸鉀法。該種方法比較簡單，但測量過程人為產(chǎn)生誤差大，且所需時間長。（2）氣量法。該種方法需準(zhǔn)備特定裝置，過程繁瑣，不易批量分析，且定量誤差比較大。（3）氣相色譜法。該種方法同樣需準(zhǔn)備特定儀器，且價(jià)格昂貴，過程復(fù)雜，不便普及。（4）可見分光光度法，該種方法的原理是通過過氧化氫酶的作用，可使過氧化氫發(fā)生分解，而形成的一種有色物質(zhì)在505nm處有強(qiáng)吸收，但該法的實(shí)驗(yàn)過程也比較復(fù)雜，同時還需提供過氧化物酶，成本比較高。因此，近年來人們希望得到一種簡單、易用、可批量分析的土壤過氧化氫酶測量方法，這對于相關(guān)領(lǐng)域的研究有著重要意義。本文的研究表明，紫外分光光度法具有很好的重現(xiàn)性、穩(wěn)定性，且操作簡便、可用于批量分析、成本也不高等，值得推廣應(yīng)用。

通過試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用紫外分光光度法的過程中，需要在振蕩后將溶液過濾到硫酸中，而不是先加酸再過濾。因?yàn)槿绻凑蘸笠环N操作方法，會使土壤中的某些有機(jī)物質(zhì)發(fā)生溶解，使得溶液出現(xiàn)顏色，進(jìn)而影響試驗(yàn)進(jìn)程。事實(shí)上，對于有機(jī)含量較高的樣品，就算用容量法，也會在很大程度上受到溶液顏色的影響。

加酸主要是用于停止酶與H2O2的反應(yīng)，而且在容量法中，用高錳酸鉀滴定時，需要在酸性環(huán)境下進(jìn)行。本試驗(yàn)結(jié)果表明，用紫外分光光度法進(jìn)行測量時，不可以在過濾前加酸，因此要將溶液過濾到盛有酸容器中，從而有可能延長酶與基質(zhì)的反應(yīng)時間，得到的結(jié)果偏高。為了縮減過濾時間，需加入飽和鋁鉀礬。結(jié)果表明，加入鋁鉀礬后，不但加快了過濾速度，而且也使其變得更加透明，不加鋁鉀礬則過濾速度較慢，溶液渾濁，從而出現(xiàn)較大的吸光度。將振蕩前與振蕩后加鋁鉀礬的吸光度比較，前者明顯超過后者，表明鋁鉀礬對過氧化氫酶起到了抑制作用，因此在振蕩后過濾前加飽和鋁鉀礬，不但能夠加快過濾速度，使溶液變得透明，而且還能夠有效抑制酶與基質(zhì)的反應(yīng)，減少誤差。總的來說，紫外分光光度法操作方便，重現(xiàn)性、穩(wěn)定性都比較理想，而且并不需要任何特殊制劑的參與，成本可控。

四、結(jié)論

本文的試驗(yàn)結(jié)果表明，紫外分光光度法在重現(xiàn)性、穩(wěn)定性上都比較突出，得到的測量結(jié)果與高錳酸鉀法無明顯差別，可以說想要測量土壤過氧化氫酶活性，紫外分光光度法是一種值得推廣的方法。

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